抗体制备课件.ppt

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1、1,第十一章 抗体制备,抗体的制备技术经历了三代：第一代抗体是传统的抗体制备方法即利用抗原免疫动物后获得抗体，称为多克隆抗体（polyclonal antibody）；第二代抗体是通过杂交瘤技术制备出针对抗原中某一抗原决定簇的抗体称为单克隆抗体(monoclonal antibody,McAb)；第三代抗体是利用基因工程技术制备而来，称为基因工程抗体(genetic engineering antibody)。本章主要介绍三种类型抗体的制备方法。,顽丽桶笑循遇雪朽里燕枯俩嘛诀幽隅予青德突评闺擎脯固番尖开伎刘絮锻抗体制备课件抗体制备课件,2,一、免疫原制备免疫原(immunogen）是指能刺激机

2、体免疫系统产生特异性抗体或致敏淋巴细胞的抗原。,巩抱沫脓吃触垒匿啥松疯帘疚卷责眠惰派汰全原辩抢肃墟褐告晃笋摔五陡抗体制备课件抗体制备课件,3,（一）细胞性抗原的制备1.绵羊红细胞的制备2.细菌抗原的制备,彩虞畅跋茸磨外扦厢鞍砌辽搂婉磷匠株睡陇卿完州狗汀哼供獭睡咨叮警菠抗体制备课件抗体制备课件,4,（二）可溶性抗原的制备1.细胞破碎（1）物理法：物理破碎法主要有高速组织捣碎机处理法、玻璃匀浆器处理法、超声破碎法、反复冻融法等方法。（2）化学法：化学法主要有酶处理法、表面活性剂处理法等方法。,咕锄吧歧醇岭朱范兼情椒名从盯以咀迢厉峨梆诚浊启烦葫疼腔獭熏烟徽诱抗体制备课件抗体制备课件,5,2.可溶性抗

3、原的提取与纯化（1）超速离心分离法（2）选择性沉淀法 盐析法：有机溶剂沉淀法：。高分子聚合物沉淀法：。等电点沉淀法：。（3）超滤法：,择拨阑骋玩署亥康钧西宴笆钙常赵朴壬你协宵也语闰完蛙淳消瘫役摇伐遣抗体制备课件抗体制备课件,6,（4）层析法 凝胶过滤法 离子交换层析法 亲和层析法（5）电泳法,董鬼裴康蛾厕野欣始痪粮洼汤殉浑项肉释渗工贵耽鸳尖醒觉凸西控创殉漳抗体制备课件抗体制备课件,7,3.纯化抗原的鉴定 抗原鉴定：含量、分子量、纯度及免疫学活性等。蛋白含量的测定可采用双缩尿法、酚试剂法、紫外光吸收法等；分子量鉴定可用SDS-PAGE法、凝胶过滤法等；蛋白质纯度鉴定方法常用的有：醋酸纤维膜电泳、

4、聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、毛细管电泳、等电聚焦、高效液相层析法等。免疫学活性鉴定常用免疫双向扩散法、免疫电泳法或ELISA法等。,岸北昧啼补痴冲娃碑块馏沉真偿绚筏臻班杯杆熊盐烦朽阉封斜窄夺圭恨英抗体制备课件抗体制备课件,8,（三）半抗原性免疫原的制备1.载体选择常用载体：蛋白质、多肽聚合物、大分子聚合物。（1）蛋白质类：常用的有人血清白蛋白、牛血清白蛋白、血蛋白等，其中以牛血清白蛋白最为常用。（2）多肽类聚合物：是由人工合成的多肽聚合物，也是一类良好的载体，常用的有多聚赖氨酸。（3）大分子聚合物：聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、羧甲基纤维素(CMC)等皆可与半抗原结合，加入福氏完全佐剂

5、可诱导动物产生良好的抗体。,播瓤抬甚争猪必剁郧纺倚归羊睦运矾惋拉窍贞谢悟腑粗奈羊卵吨叙民偶滋抗体制备课件抗体制备课件,9,2.连接方法 半抗原与载体的连接有物理法和化学法。物理法是用物理吸附法将载体与半抗原连接，其原理是通过电荷和微孔来吸半抗原，吸附载体主要有PVP和CMC等；化学法是利用某些功能基团把半抗原连接到白质类或多肽类聚合物载体上。不同的半抗原应选用不同的方法进行连接。,坞渤钉度虑谱兔柒矽腥瓤痰笋芥专褂还慈馋牢记昆种惺混促弥胰仇木倘撩抗体制备课件抗体制备课件,10,根据半抗原拥有的化学基团不同，连接方法主要有以下几类：带游离氨基或羧基以及二种基团皆有的半抗原：羧基可用混合酸酐法和碳二

6、亚胺法与载体氨基形成稳定的肽键，带氨基的半抗原则可与载体羧基缩合。带有羟基、酮基、醛基的半抗原：不能直接与载体连接，需要用化学方法如琥珀酸酐法、O-（羧甲基）羟胺法等方法将之转变为带有羧基的半抗原衍生物后才能与载体连接。带有酚基的半抗原，可用一氯醋酸钠法或重氮化的对氨基苯甲酸法，生成带有羧基的半抗原衍生物。,发晃含绅爬吹赞韩濒鲁踪蹭酷酱咯昔祝淫嚎钒豆伯罗氖瞧侯侄吭种痴仙了抗体制备课件抗体制备课件,11,（五）免疫佐剂某些物质与抗原一起或先于抗原注入机体，可增强机体对该抗原的特异性免疫应答或改变免疫应答类型，此类物质称为免疫佐剂(immunoadjuvant)，简称佐剂。,频刽峡唁思卞砌烘肤绳样

7、早煽肘管惧汹歉磊晒圃滇忿芝剂决兴融晃雇井搂抗体制备课件抗体制备课件,12,佐剂的种类 佐剂一般包括以下几类：无机佐剂，如氢氧化铝、明钒等；生物性佐剂，如结核分枝杆菌、卡介苗、小棒状杆菌、百日咳杆菌、革兰阴性杆菌内毒素、霍乱毒素的B亚单位、胞壁酰二肽和细胞因子等；人工合成佐剂，如双链多聚肌苷酸：胞苷酸（poly I：C）、双链多聚腺苷酸：尿苷酸（poly A：U）；油剂，如弗氏完全佐剂、花生油乳剂等；纳米佐剂。,越喳舰阶姑梁卸讫谨旷核悦作狰颈匀厂昔汀探办适傲效展瓷巫刑吭桌财抚抗体制备课件抗体制备课件,13,弗氏佐剂（Freunds adjuvant）,分为弗氏不完全佐剂和完全佐剂两种：前者是由油

8、剂（矿物油或花生油）和乳化剂（羊毛脂或吐温-80）按1：11：5比例混合而成；后者由弗氏不完全佐剂加卡介苗组成。在免疫动物时，先将弗氏佐剂与抗原等比混匀，制成“油包水”乳化液。,垄风罗沽珐铀衔拒扼转蓖氏航牟懊观秦住鼎然瓣惯搪术噶凡廓褒解冒郸碱抗体制备课件抗体制备课件,14,佐剂与抗原混合乳化的方法：研磨法和搅拌混合法两种,腋掖牧矛讳春埂硝哨纵伐赶掐仕粕碟缕兴锰筐姚葬足屠载庞草伸泵裳摔起抗体制备课件抗体制备课件,15,2.佐剂的免疫生物学作用增强抗原免疫原性：使无或微弱免疫原性的物质变成持久或强的免疫原；增强机体对抗原刺激的反应性，提高初次应答和再次应答所产生的抗体滴度；改变抗体类型，使产生抗体

9、由IgMG型转变为IgG型；引起或增强迟发性超敏反应。,钳叙妨腊腑协狄捻嚎汽迂屿巍垃畜额摩答蒸嫡纺践研市翌姑秘筑孩吵占嚼抗体制备课件抗体制备课件,16,3.佐剂的作用机制 佐剂的作用机制归纳起来主要有如下几种：可增强抗原的表面积和改变抗原活性基团构型，从而增强抗原的免疫原性；佐剂与抗原混合一起注入机体，可改变抗原的物理性状，形成抗原储存库，延长抗原在局部组织的滞留时间，有利于抗原的缓慢释放；增强吞噬细胞的吞噬作用（被佐剂吸附的抗原易被吞噬细胞吞噬），促进对抗原的处理，刺激淋巴细胞增生，从而增强和扩大免疫应答的效应。,座醛赁幽服涎葫追仅埂呻谨传砌嚣弱饼诛又泊镇段惺汤憋眩崩瘫抒捉滁歉抗体制备课件抗

10、体制备课件,17,二、免疫动物,为获取高质量的抗体，除了需制备高纯度的抗原外，还需选择适宜的动物和设计有效可行的免疫方案，如抗原的剂量、剂型、注射途径、注射次数、注射间隔和接种动物的年龄均与免疫效果密切的关系。,爵眉桩娟绚茶神催慷饮迟意宏繁晴贷击戴稚爵娄贰胡齐蔷振篡堕标俺植法抗体制备课件抗体制备课件,18,1.免疫动物的选择 选择动物时应考虑以下因素：抗原来源与动物种属的关系。抗原的来源与免疫动物种属差异越远，其免疫源性越强，免疫效果越好，而同种系或亲缘关系越近，免疫效果越差。动物个体的选择。适龄、健康、体重符合要求的正常动物（以雄性为佳）；抗体需要量少时，选用家兔、豚鼠和鸡等小动物；抗体需要

11、量大时，可选用绵羊、山羊、马、驴等大动物。抗原性质与动物种类。,垣裸筒帖育盲鲤量鼓呛泄疫瘟颖蜡曰耀嘲灭睬赛撰惮静锯重洒恨红掌挥其抗体制备课件抗体制备课件,19,2.免疫方法 选定动物后，在免疫过程中应考虑免疫剂量、免疫途径、免疫次数、免疫间隔等因素。(1)免疫原的剂量：免疫原的接种剂量按免疫原性的强弱、动物的个体状态和免疫时间来确定。首次免疫时，剂量不宜过大，以免产生免疫麻痹。,驳督喂雅桨蜀绘泡奏秀防戍咽脏愚揣拦馋枝俩炎菏呵狙航雷甜佩诺戮颈绵抗体制备课件抗体制备课件,20,(2)免疫途径与免疫间隔时间 免疫途径通常有皮内、皮下、肌肉、静脉、腹腔、淋巴结等，视不同的免疫方案而异。对于不易获取的宝

12、贵抗原可采用淋巴结免疫法。免疫间隔时间是影响抗体产生的重要因素，其中首次与第二次免疫的间隔时间尤为重要，一般以1020天为佳，二次后间隔时间一般为710天，若间隔时间太长，则刺激减弱，抗体效价不高。,必粒塑锁诲亿卜耸称镭褂菊涂惧谦袜池窟掷衍韧积昨式泞国昔佬贵宦蝴桨抗体制备课件抗体制备课件,21,3.动物采血 采集免疫血清前，要预先测试抗体效价测定，若效价达到要求，应在末次免疫后一周及时采血，否则抗体效价会下降。(1)颈动脉采血法(2)心脏采血法(3)静脉采血法,妆奈癣络崎族姑祈师纷与猿遏俩蓖巨淡办辣乱莆傀赞候嘉舜舞怀痪见悄泰抗体制备课件抗体制备课件,22,图1 颈动脉分离图,览色鹃老青捌况恍日

13、卧习幽鸯抹倚瞻辖侵隘挠吵醛汪吓表剑券挤粮褐嚎嫂抗体制备课件抗体制备课件,23,三、免疫血清的纯化,1.特异性抗体的纯化 免疫原不纯，导致产生杂抗体混杂于抗血清中。杂抗体的除去可采用：。(1)亲和层析法（2）吸附法,婉泉间锰捕仑旗甥碍播饿欺桌甸御荤蒲爵衡簿俭茁虽溯冉骗回疹箕代卿偏抗体制备课件抗体制备课件,24,2.IgG类抗体的纯化 IgG类抗体的纯化常用方法有盐析法、凝胶过滤、离子交换层析、亲和层析等方法。(1)盐析法：硫酸铵盐析常用于-球蛋白提取，经三次沉淀后提取的-球蛋白大多属于IgG。,皱挨凌私叉突詹栈饰蹲刊曼且呛乾藤简历溯格裙惨逸营岔猾掐碗亥瞒肚贴抗体制备课件抗体制备课件,25,(2)

14、凝胶过滤法：各种蛋白质成分的分子量大小不同，在通过凝胶介质时，洗脱速度也不同，从而达到分离目的。血清蛋白的分级分离常用凝胶过滤法进行，按分子大小可分为三组：第一组包括IgM和一些脂蛋白；第二组主要是IgG和较少量的IgA、IgD、IgE等球蛋白；第三组主要白蛋白、血清粘蛋白、铁传递蛋白等（见图2）。,爆拽锡扦痪脂躇带上戈奄簿帝溯坊舜骗逆暑涧父逊壁叹找秽拂慈策窄机隐抗体制备课件抗体制备课件,26,图2 在凝胶过滤柱上血清蛋白的层析示意图(M=IgM,G=IgG,A=IgA),辱迄撩喉懂曝雾谎阅剔注拜暴恕哟虾匡群碴诱和磨狙筛救滚钩百枉粤斯争抗体制备课件抗体制备课件,27,(3)离子交换层析法纯化I

15、gGIgG作为一种-球蛋白，在血清蛋白中带电荷较最少，用离子交换层析法易于分离。DEAE-Sephadex A-50是一弱碱性离子交换剂，常用于免疫球蛋白的纯化。血清中的-球蛋白属于中性蛋白，其余均属酸性蛋白。在pH7.27.4的环境中,酸性蛋白被DEAE-Sephadex A-50吸附，-球蛋白不被吸附而得以纯化。该技术纯化IgG简便，不损坏抗体结构和特异性。,净辐发颅卯垦名灰寥商最辈癣漠矣隐胖栓间猜蜘扩形搓赡院商窒埂潮镁蝴抗体制备课件抗体制备课件,28,图3 在DEAE-纤维素上人血清蛋白的层析示意图(M=IgM,G=IgG,A=IgA),黄主怀镐竞皿满苛枣奈少鲸瘸呀润逸阉星牟氖恫月蜘奔如

16、虹虚洁濒缉决澄抗体制备课件抗体制备课件,29,(4)亲和层析法纯化 葡萄球菌A蛋白（SPA）或连球菌G蛋白具有与IgG Fc段结合的能力，可用亲和层析来分离IgG。分离时可采用两种类型的亲和层析柱即SPA或G蛋白交联至Sepharose 4B制成的亲和层析柱。抗血清通过层析柱时，IgG被吸附，而非特异性蛋白则未能结合被洗脱除去，然后改变洗脱条件，使IgG从层析上解离从而达到纯化目的。,礼薄谍唁恭忌挞囱队梭泉薛串寇仪补城斋雹遁哉溺迈帧戊灶付泳饼誉炔杨抗体制备课件抗体制备课件,30,图4 亲和层析纯化IgG基本过程示意图,抓郊场庐骏芝迁鹊赌咬酶彬袍肠当卞提吻漆澡介帘猴贴苦卸缄芥巴翁匀按抗体制备课件

17、抗体制备课件,31,四、免疫血清的鉴定1.效价的测定：颗粒性抗原可采用凝集试验，可溶性抗原常用双向免疫扩散试验、ELISA等方法。2.特异性的鉴定：抗体特异性鉴定常用双向免疫扩散法、免疫电泳法。,暗锦汲饰芦弯序氢援仕巾厉舰卡蕴仰畏顶庙炔袄洗臂窄应脐椭页腥平胸讫抗体制备课件抗体制备课件,32,3.纯度的鉴定：抗体纯度的鉴定可采用SDS-聚丙酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、双向扩散试验、免疫电泳等方法。IgG含有重链和轻链，纯IgG的SDS-PAGE结果应有两条蛋白电泳带（分子量约53kD和22kD），若出现多条电泳带则表明制备的抗体混有杂蛋白，需进一步纯化。4.亲和力的鉴定：测定抗体亲力的方法

18、较多，如平衡透析法、ELISA或RIA竞争结合试验等。,伙种淘辅南垄贝渝彻否豫恫奎恭壕壳坞猿拭亮彝焊答顿蓬赣楞扯赎锋籍写抗体制备课件抗体制备课件,33,五、免疫血清的保存 4保存：存放于4冰箱，一般可可保存半年，效价高时可保存一年，但抗体活性有些降低。低温保存：是常用的抗体保存方法，将抗体分为小包装于-20-70保存，一般可保存5年抗体效价无明显下降，但要避免反复冻融。真空干燥保存：用冷冻真空干燥器进行干燥，制成干粉，封装后可在普通冰箱中保存510年抗体效价无明显变化。,触垢会蹭佯吧霄灿熊攀仇唉题朋封便师掸撒拣脱陶剔凌剔锗饶春辈咆冻怒抗体制备课件抗体制备课件,34,第二节 单克隆抗体的制备 P

19、reparation of monoclone antibody,克隆(clone)是指无性繁殖 细胞系，是由单一个祖先细胞分裂繁殖而形成的一簇细胞纯系。在这个家族的所有成员中，如无突变发生，其基因是完全相同的。,薪五牺蒸坚俗邓茎硅队温郴镇比惧嗽子颓鱼奏踏绝嗽地严狡炳舅肝硝盅淖抗体制备课件抗体制备课件,35,单克隆抗体（McAb）,是由只识别单一抗原决定簇的B细胞克隆产生的同源抗体。,其理化性状高度均一、效价高、只与一种抗原表位发生反应、生物活性单一，具有高度特异性又易于大量制备,篆侵贴队问绣鞍桥褪求考凝坊盖元痛拈赵罩音届韶份楼忧堆蛰枫哨旧顽蛇抗体制备课件抗体制备课件,36,单克隆抗体制备方法

20、：,杂交瘤技术EBV技术,速付攻涟氢抛树显询男斩惑堑岳肥底尔迂炼酗筑辗弛蹭蓄蓉弓吞伎伞氮汁抗体制备课件抗体制备课件,37,杂交瘤单克隆抗体?,通过抗原致敏B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞，经克隆化培养所形成单克隆杂交瘤细胞克隆，所分泌的针对抗原上某一抗原表位的纯的抗体，具有生物活性单一，理化性质高度均一，产量高等特点。,披泪按促结霹互消冻拍颜饯股猾庆笋办谁访速獭涸请泛培样琴箭让仑政耙抗体制备课件抗体制备课件,38,一、杂交瘤技术的基本原理,纵晕具坞镊曙茧辽骸砌骤簧你念元输揍器逾泽豫赁胀祟裕谨莲贫课宗爹忧抗体制备课件抗体制备课件,39,一、杂交瘤技术的原理及流程,胡沿挂耪斥昨杰盲贬泽捂霍

21、独牌坦忘叮魁嫂桥藐彦崔澡佐忍雹裳竖刘隘扬抗体制备课件抗体制备课件,40,症谓剐励囱魁哉涡灵狸珊债眶洁枢坷政为淤南裴拘绒谦辐露桅封糙月蜂荷抗体制备课件抗体制备课件,41,掸摈相蕊忽国允佩坏缅腐囚效焙税碱励吭揉佳驾纂蟹宪吵阐乖庚茂淬衫订抗体制备课件抗体制备课件,42,二、单克隆抗体制备技术,主要材料细胞融合前准备细胞融合 抗体的初筛和克隆化杂交瘤细胞冻存与复苏单克隆抗体的批量生产单克隆抗体的纯化与鉴定,侨毗昌蹿育勒舵仓黄肺戳球唐餐期引悯骨穗篇呈哺颠戌吃婪颠追朽贿攒不抗体制备课件抗体制备课件,43,（一）主要材料：,RPMI1640培养液 FCS 10%谷氨酰胺 2mmol/L 青霉素 100IU/

22、ml 链霉素 100Ug/ml,慈不棉有雪哭涣庭蔷竣奋杨轧牵孽匪筷典怯荷述昆豢滞辗弛亥惩欠拘柴谤抗体制备课件抗体制备课件,44,100X HAT贮存液,H 13.6mg/mlA 0.019mg/mlT 0.388mg/ml,赠合涪楼产郊闺谱矮澈兄咐踢德剁卷蕴道餐瑚悉平屉龟岁名捂盗网显营咏抗体制备课件抗体制备课件,45,100X HT 贮存液,H 13.6mg/mlT 0.388mg/ml,且块蚀脑寻瞄磅肾谅逝慌舶疥拳虽编豆滩刻次瑚蒂孤斤霍囱料贝露馏扰蝇抗体制备课件抗体制备课件,46,8-杂氮嘌啉,8-杂氮嘌啉 200mgDW:10ml加1NNaOH 至溶解加DW至 20ml过滤除菌 分装-20

23、 0C保存,挫如匪柠共盗核札灵央妊惯瓜瘫备因薄檬拓绅刊还距闸妓溜譬馁汽你屠正抗体制备课件抗体制备课件,47,聚乙二醇,PEG:3050%P=m/(m+v)100%,脊脊姿桂叠浪过徽赔抑肖见皿娱厨搐讣斋踞憋肛陶甩咀墅钉寐泛掷为韧纬抗体制备课件抗体制备课件,48,（二）细胞融合前准备,1.免疫方案 颗粒性抗原 可溶性抗原 2.饲养细胞 3.骨髓瘤细胞 4.免疫脾细胞,用郭辈否剩镜界簧募传惜岂催钉曾规行私猩盼霞渴柞沾怖蔷巨理心忻碑斟抗体制备课件抗体制备课件,49,初次免疫 Ag150g加福氏完全佐剂皮下多点注射(一般0.81ml0.2ml点)3周后 第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip(i

24、p剂量不宜超过0.5ml)3周后第三次免疫剂量同上，不加佐剂，ip(57天后采血测其效价，检测免疫效果)23周后 加强免疫，剂量50500g为宜，ip或iv3天后取脾融合,宪理昌权蛙轿爽野铁渍谨景绸盟缺萝据拭骗掸桃奇进滇霓扫读框悍檀冒抡抗体制备课件抗体制备课件,50,初次免疫 1100.5ml ip(腹腔内注射)23周后第二次免疫 1100.5ml ip3周后加强免疫(融合前三天)1100.5ml ip或iv(静脉内注射)取脾融合,封单孪蓉婿翼据寻晚整琶垄龟淳厉钦病栖熄涪饱焊仑内空绵感膘斧嗅拷肤抗体制备课件抗体制备课件,51,小鼠腹腔巨噬细胞的制备 常用BaLbc小鼠610周龄 拉颈处死浸泡于

25、75酒精，消毒35分钟 用无菌剪刀剪开皮肤，暴露腹膜 用无菌注射器注入68ml培养液 反复冲洗，吸出冲洗液 放入10ml离心管，1200转分离心56分钟 用20小牛血清(NCS)或胎牛血清(FCS)的培养液混悬，调整细胞数110ml 加入96孔板，100l孔 放入37CO2孵箱培养,季温炒巨趋瘴吹妻合责流皆昼泪挥涉夷寨询懦奉辰圃烃飘吏苛燎殖坷厢茎抗体制备课件抗体制备课件,52,常用骨髓瘤细胞系有：NS1SP20X63 Ag8.653,怀儒慌鞋咒售眩浊鼻淡电疽找奋纬佬拢蹦渣贪技赞祟迄跟荒品砸血祥覆捐抗体制备课件抗体制备课件,53,集鹅百魔帖酗砚血址理寓值聪蓬幅汁寨接疏折恋守扩水衡宣嫌呀幅绦册娱抗

26、体制备课件抗体制备课件,54,骨髓瘤细胞系选择要点：,动物品系相同不产生免疫球蛋白重链和轻链对HAT敏感融合后产生稳定性高的杂交瘤细胞,纵余窘脸缄踞铰息信莆逮厩激藉采畦仅晴罚销痕漱动诛滇踢雌伞嘉究帚刁抗体制备课件抗体制备课件,55,脾细胞悬液的制备：在无菌条件下取出脾脏，用不完全的培养液洗一次，置平皿中不锈钢筛网上，用注射器针芯研磨成细胞悬液后计数。一般免疫后脾脏体积约是正常鼠脾脏体积的倍，细胞数为10左右。,岗臼违验勤剐矫汞诚悄条戍贺菱释籽藐显醒唱银蚕董戍勾雇寸毒智繁痊喘抗体制备课件抗体制备课件,56,1.细胞融合 2.HAT选择杂交瘤,(二)细胞融合，选择杂交瘤,舍敝氢街牢烹询犀障滤剐厘忍

27、瞧仅缅轩彝椽皆亦曹姑渺丧公蔬蝇航窄代寡抗体制备课件抗体制备课件,57,（三）抗体初筛与克隆化,以快速、简便、特异、敏感的方法为原则。常用的方法有:1.ELISA用于可溶性抗原(蛋白质)、细胞和病毒等McAb的检测。2.RIA用于可溶性抗原、细胞McAb的检测。3.FACS(荧光激活细胞分类仪)用于检查细胞表面抗原的McAb检测。,办瞩唤帮钓钦陵酶祖位誓伯辨疙兜流猎缮孔目鼻骤沉宋镶稻幅役皖矣炒锁抗体制备课件抗体制备课件,58,（四）杂交瘤的冻存和克隆化,1.克隆化方案用克隆化的方法很多，而最常用就是有限稀释和软琼脂平板法。(1)有限稀释法的程序(2)软琼脂法,逻傣掸仪菏焊澜测插疤箔托恕酥听诡亭簧

28、归藉焰茬速甘委妹返依遮腑考嘶抗体制备课件抗体制备课件,59,溉拿败录炕壤除歇细现鸟裳符蜜瞥皆查藕柴廉瞬遵茄胡汐经毛狭稀伐碉统抗体制备课件抗体制备课件,60,2.杂交瘤细胞的冻存,细胞冻存液:50小牛血清40不完全培养液10DMSO(二甲亚砜),炸唤劣傍修涌渝赃淘阉汛冰妆忙四榜玛盅果墓橙拣固娄逞截盎炬崩脊阐荷抗体制备课件抗体制备课件,61,（五）单克隆抗体的大量生产,大量生产单克隆抗体的方法主要有两种：1.体外使用旋转培养管大量培养杂交瘤细胞，从上清中获取单克隆抗体。但此方法产量低，一般培养液含量为1060gml，如果大量生产，费用较高。2.体内接种杂交瘤细胞，制备腹水或血清。,剩要吻梨敝救映逃

29、躺织鼻寻炼迈史腑遏反敲会弛攀狰佯设袍砖婪封室找踌抗体制备课件抗体制备课件,62,（六）单克隆抗体的鉴定,1.抗体特异性的鉴定：2.McAb的Ig类与亚类的鉴定：3.McAb中和活性的鉴定：4.McAb亲和力的鉴定：,径湖跋章导踩移剐寇呼特掸铭濒髓椭溺斥署旬胁免饼筷掳到撼酬巢磨娄逝抗体制备课件抗体制备课件,63,抗体的纯化：,硫酸铵沉淀离子交换层析SPA-sepharose 亲和层析柱分离,畔袁接延犀惭词毕欠酪仁伎杉认诫绥末对彻馒节沫醋瘦耽碌森为纷拢岳浮抗体制备课件抗体制备课件,64,第四节 基因工程抗体技术 Genetic Engineering Technique,是指应用NDA重组及蛋白工

30、程技术对编码抗体的基因按不同的需要进行改造和装配，经导入适当的受体细胞后重新表达的抗体,基因工程抗体(重组抗体),量注幌揽舷服毡阀牲揪继磁鸡鞠仙剥佬遂寝捷钳廉贞二科历尊她纲朔跌怕抗体制备课件抗体制备课件,65,基因工程抗体技术,用DNA重组和蛋白工程技术对已有的单抗进行改造。包括人源化抗体、小分子抗体、双价特异性抗体和抗体融合蛋白等的制备。用抗体库技术筛选、克隆新的单抗。,贸侨闷命摄贪包掠用茨宝耙砚驱肢倪权社哥宁匀蓟堆侄栋借携绞伐请闲毖抗体制备课件抗体制备课件,66,一、人源化抗体,嵌合抗体Chimeric antibody改形抗体 Reshaped antibody,伐弃姐疆椰沦湾揪兔殃舞姨

31、痛漂典非宽抄症运汛逾隋趟嘶采朔紊珐脯当桩抗体制备课件抗体制备课件,67,榨各傻句履终爷微毛买疏童策镇嘘嫁告诬碾淹湛旨怀皮疾桑态冒讥饮晃葬抗体制备课件抗体制备课件,68,布浆凯你稽绽鲜因歹袍痘诈嘿纪镇肥阑哈疑刹索顽樊倔服夷栈抨靖谊校先抗体制备课件抗体制备课件,69,舷孕阁班郝辗挪垣故圾办铆问少岂巨悼轴格始装簇郊贡界泼宛例半伍谷雌抗体制备课件抗体制备课件,70,二、小分子抗体,指分子量较小但具有抗原结合功能的分子片段。,抗原结合片段（Fab）可变区片段（Fv）单链抗体（single chain Fv，ScFv）,谆吹沟幽晓诛琐咸柑诡肌曰渣松歹闭充去罚窄冶擎又哗缀齐痘除款桓盘呼抗体制备课件抗体制备课

32、件,71,张嘻肩槐墨汁辣柯素另焦侩邵拭歪桥糟闲欣细芭害见拼六迄彼柒做结出嘛抗体制备课件抗体制备课件,72,淖光矿帕胁轩卓眠碧贞崔舅丢酿砖珐帐佩腕姓康叼邵剔眠哨总舔戈呕俱俱抗体制备课件抗体制备课件,73,三、双特异性抗体（bispecific antibody，BsAb）,双特异性抗体，双功能抗体其两个抗原结合部位具有不同的特异性，可以同时与两种不同特异性的抗原发生结合。,般霸戌瞻赡旷男嫌筐纠轮春袜涅接封疑养券义屯众喉姐住友舰菏儒协哈勋抗体制备课件抗体制备课件,74,双特异性抗体（BsAb）种类：,（一）化学绞链BsAb（二）细胞工程BsAb（三）基因工程BsAb,封暴黍苑踪三刃昨诫掷蛇攫菲紧藉

33、缅神乐细爆侈赔拦血王兴毕乱讲院牛庸抗体制备课件抗体制备课件,75,四、抗体融合蛋白,（一）含Fv的抗体融合蛋白（二）含Fc的抗体融合蛋白,抗体融合蛋白是指将抗体分子片段与其他蛋白融合所得到的产物,扼界橙掸物哈缔瘤品妒眨睡旷关介千喂庞诈熬五顺和库牺碳姨江凡静酚忘抗体制备课件抗体制备课件,76,第五节 抗体库技术,噬菌体抗体噬菌体抗体库噬菌体抗体技术,拱贵歹资葛食较增挠蚜布讣云炬惋吹揍炸剐邱胺玻袭嗅凰蔬伺扎柱咒欧团抗体制备课件抗体制备课件,77,趟纲彭盛铸筋副年沁禄短内玄唇乞奸尼焕沾堤限蹄博碗帘大纤购肇显嗣漏抗体制备课件抗体制备课件,78,收荚颖雅宁眯雾其嚎夷褪抓陇懒镭稳汾毕喜愿芥倦皱墨抱幻猫椒乒仇舷著抗体制备课件抗体制备课件,79,总结,名词解析：佐剂，单克隆抗体，杂交瘤单克隆抗体，基因工程抗体，嵌合抗体，改型抗体，小分子抗体，双特异性抗体，抗体融合蛋白，问答题：1.佐剂的种类和作用机制。2.杂交瘤单克隆抗体的制备原理和技术流程。,辅辑膝炸累病吵冲幕祭计垣红昭肠蔑稳启滥烬党镇绷的睹轿奋阮恫尹瓷桌抗体制备课件抗体制备课件,