氨基酸发酵工艺.ppt

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1、1 概述,氨基酸的应用 1、食品工业：营养强化剂、鲜味剂、甜味剂。2、饲料工业：营养强化剂。3、医药工业：氨基酸输液、氨基酸衍生物、氨基酸盐。4、化学工业：洗涤剂，护肤品，人造革。5、农业：无公害农药。,1 概述,氨基酸的应用食品工业：强化食品：谷物中缺赖氨酸，苏氨酸，色氨酸、蛋氨酸。增鲜剂：谷氨酸单钠和天冬氨酸。苯丙氨酸与天冬氨酸可用于制造低热量二肽甜味剂(-天冬酰苯丙氨酸甲酯),此产品1981年获FDA批准,现在每年产量已达数万吨。,1 概述,氨基酸的应用食品工业：大豆蛋白的氨基酸组成影响其营养效价。,氨基酸名称缩写,1 概述,氨基酸的应用医药工业：多种复合氨基酸制剂可通过输液治疗营养或代

2、谢失调;苯丙氨酸与氮芥子气合成的苯丙氨酸氮芥子气对骨髓肿瘤治疗有效,且副作用低。,1 概述,氨基酸的生产方法 1、发酵法（1）直接发酵 野生菌株 营养缺陷型突变 抗氨基酸结构类似物突变株 抗氨基酸结构类似物突变株的营养缺陷型菌株 营养缺陷型回复突变株发酵。（2）添加前体的发酵,1 概述,氨基酸的生产方法 2、酶法：利用酶来制造氨基酸。3、提取法：蛋白质水解液中提取。胱氨酸、半胱氨酸和酪氨酸 4、合成法：DL-蛋氨酸、丙氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸 传统的提取法、酶法和化学合成法由于前体物的成本高,工艺复杂,难以达到工业化生产的目的。,1 概述,氨基酸的国外生产概况 日本和德国为世界主要氨基酸生产国。

3、日本的味之素、协和发酵及德国的德固沙是世界氨基酸生产的三巨头。它们能生产高品质的氨基酸，可直接用于输液制剂的生产。日本在美国、法国等建立了合资的氨基酸生产厂家，生产氨基酸和天冬甜精等衍生物。,1 概述,氨基酸的国内生产概况天津氨基酸公司、湖北八峰氨基酸公司 生产规模及产品质量与国外大厂有较大差距。在80年代中后期,我国从日本的味之素、协和发酵以技贸合作的方式引进输液制剂的制造技术，1991年销售量为二千万瓶，1996年达六千万瓶，主要厂家有无锡华瑞，北京费森尤斯，昆明康普莱特，但生产原料都依赖进口。,2 氨基酸发酵的代谢控制,控制发酵的环境条件 氨基酸发酵受菌种的生理特性和环境条件的影响，对专

4、性需氧菌来说环境条件的影响更大。谷氨酸产生菌因环境条件的影响会引起发酵的转换，生成各种不同的产物。,2 氨基酸发酵的代谢控制,溶解氧：乳酸或琥珀酸 谷氨酸 酮戊二酸（通气不足）（适中）（通气过量、转速过快）NH4+:酮戊二酸 谷氨酸 谷酰胺（缺乏）（适量）（过量）pH：谷酰胺，N乙酰谷酰胺 谷氨酸（pH 5-8，NH4+过多）（中性或微碱性）磷酸：缬氨酸 谷氨酸（高浓度磷酸盐）生物素：乳酸或琥珀酸 谷氨酸（过量）（限量）,2 氨基酸发酵的代谢控制,控制细胞渗透性 代谢产物的细胞透性是氨基酸发酵的重要因素，只有使细胞内的氨基酸渗透到细胞外，才能大量积累氨基酸。（1）生物素、油酸和表面活性剂，引起

5、细胞膜的脂肪酸成分的改变。（2）青霉素：抑制细胞壁的合成，由于细胞内外的渗透压差使谷氨酸泄漏出来。,2 氨基酸发酵的代谢控制,2 氨基酸发酵的代谢控制,控制旁路代谢 例如：L异亮氨酸的生物合成可由L苏氨酸改为D苏氨酸途径，即采用旁路代谢。,2 氨基酸发酵的代谢控制,2 氨基酸发酵的代谢控制,降低反馈作用物的浓度 控制反馈作用物浓度，克服反馈抑制和阻遏，使氨基酸的生物合成反应能够顺利进行。,2 氨基酸发酵的代谢控制,2 氨基酸发酵的代谢控制,消除终产物的反馈抑制与阻遏作用 消除终产物的反馈抑制与阻遏作用，是通过使用抗氨基酸结构类似物突变株的方法来进行。例：利用抗性突变株消除S-(-氨基乙酸)-L

6、-半胱氨酸（即AEC）（赖氨酸的结构类似物）与L-苏氨酸的协同抑制。,2 氨基酸发酵的代谢控制,2 氨基酸发酵的代谢控制,促进ATP的积累，增加氨基酸的生物合成 氨基酸的生物合成需要能量，ATP的积累可促进氨基酸的生物合成。,2 氨基酸发酵的代谢控制,3 氨基酸发酵的工艺控制,培养基pH温度氧,3 氨基酸发酵的工艺控制,培养基 1、碳源：淀粉水解糖、糖蜜、醋酸、乙醇、烷烃 碳源浓度要适当，避免碳源浓度过高，否则对菌体生长不利，氨基酸的转化率降低。菌种性质、生产氨基酸种类和所采用的发酵操作决定碳源种类。,3 氨基酸发酵的工艺控制,培养基 2、氮源：铵盐、尿素、氨水，同时调整pH值。营养缺陷型需要

7、添加适量氨基酸时，主要添加有机氮源水解液。需生物素和氨基酸时，以玉米浆作氮源。尿素灭菌时分解或形成磷酸铵镁盐，须单独灭菌，40的尿素可在10840min，高温会生产缩脲。氨水用pH自动控制连续流加。,3 氨基酸发酵的工艺控制,培养基 3、碳氮比 氮源除用于菌体生长外，还用于氨基酸合成，在氨基酸发酵中常常是用氨水、尿素来调节pH，所以氨基酸发酵所用的C/N比一般微生物发酵的低，或者说氮源用量更高。,谷氨酸发酵在C/N小于100:11时才开始积累谷氨酸，所以通常情况下谷氨酸发酵C/N为100:(1530)。合成菌体使用36的氮源；合成谷氨酸用去3080氮源。,3 氨基酸发酵的工艺控制,培养基4、N

8、H4+浓度：过低增加-酮戊二酸积累，过高使谷氨酸转化为谷氨酰胺。5、磷酸盐：对发酵有显著影响。不足时糖代谢受抑制。6、镁：是已糖磷酸化酶、柠檬酸脱氢酶和羧化酶的激活剂，并促进葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活力。7、钾：促进糖代谢。谷氨酸产酸期钾多利于产酸，钾少利于菌体生长。,3 氨基酸发酵的工艺控制,培养基8、钠：调节渗透压作用，一般在调节pH值时加入。9、锰：是许多酶的激活剂。10、铁：是细胞色素、细胞色素氧化酶和过氧化氢酶的活性基的组成分，可促进谷氨酸产生菌的生长。11、铜离子：对氨基酸发酵有明显毒害作用。,3 氨基酸发酵的工艺控制,培养基生长因子：生物素 作用：影响细胞膜透性和代谢途径。浓度：过

9、多促进菌体生长，氨基酸产量低。过少菌体生长缓慢，发酵周期长。与其它培养条件的关系：氧供给不足，生物素过量时，发酵向其它途径转化。来源：玉米浆、麸皮水解液、甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜。,3 氨基酸发酵的工艺控制,pH对氨基酸发酵的影响及其控制 作用机理：主要影响酶的活性和菌的代谢。控制pH方法：流加尿素和氨水 流加方式：根据菌体生长、pH变化、糖耗情况和发酵阶段等因素决定。,3 氨基酸发酵的工艺控制,pH对氨基酸发酵的影响及其控制 控制：（1）菌体生长或耗糖慢时，少量多次流加尿素，避免pH过高（2）菌体生长或耗糖过快时，流加尿素可多些，以抑制菌体生长。（3）发酵后期，残糖少，接近放罐时，少加或不加尿素，

10、以免造成氨基酸提取困难。（4）氨水对pH影响大，应采取连续流加。,3 氨基酸发酵的工艺控制,温度对氨基酸发酵的影响及其控制菌体生长达一定程度后再开始产生氨基酸，因此菌体生长最适温度和氨基酸合成的最适温度是不同的。谷氨酸前者3032C，后者3437C。菌体生长阶段温度不宜过高，否则菌体易衰老，pH增高，糖耗减慢，酸产量低。当菌体生长温度过高时：要减少通风量，少量多次流加尿素，来促进菌体生长。发酵中后期：维持合成温度，以利氨基酸合成。,3 氨基酸发酵的工艺控制,氧对氨基酸发酵的影响及其控制要求供氧充足的谷氨酸族氨基酸发酵：生物合成与TCA循环有关。适宜在缺氧条件下进行的亮氨酸、苯丙氨酸和缬氨酸发酵

11、：菌体呼吸受阻时产量最大。供氧不足时产酸受轻微影响的天冬氨酸族氨基酸发酵,4 谷氨酸生产工艺,谷氨酸生产概述起初工业化生产采取小麦或大豆蛋白质水解制取。1957年，日本率先采用微生物发酵生产，并实现工业化，被誉为现代发酵工业的重大创举，使发酵工业进入调节调控水平。目前世界产谷氨酸钠30吨/年，占氨基酸总量的2/3。我国现有200余家生产，年产量达15万吨，居世界首位。,谷氨酸发酵生产流程,4 谷氨酸生产工艺,谷氨酸产生菌株特点革兰氏阳性不形成芽胞没有鞭毛，不能运动需要生物素作为生长因子在通气条件下才能产生谷氨酸不易被低浓度的谷氨酸抑制,4 谷氨酸生产工艺,谷氨酸生物合成机理 由三羧酸循环中产生

12、的a-酮戊二酸，在谷氨酸脱氢酶和氢供体存在下进行还原性氨化作用而得到。,GLDH,NADPH,NADP+,GLDH：谷氨酸脱氢酶,以HMP为主，HMP 约占90%,CO2,氨的导入方式：,-酮戊二酸还原氨基化谷氨酸,由天冬氨酸或丙酮酸通过氨基转移，将氨基转给-酮戊二酸,谷氨酸合成酶途径,CO2,CO2,葡萄糖,磷酸烯醇丙酮酸,丙酮酸,乙酰CoA,草酰乙酸,天冬氨酸,柠檬酸,-酮戊二酸,谷氨酸,反馈抑制,优先合成,增强反馈抑制,谷氨酸合成调节机制,影响谷氨酸合成的因素,4 谷氨酸生产工艺,淀粉的酸水解工艺1、调浆：干淀粉用水调成10-11Bx（白利度）的淀粉乳，加盐酸0.5-0.8至pH 1.5

13、。2、糖化：蒸汽加热、加压糖化25min。3、中和：冷却至80，烧碱中和至pH 4.0-5.0（避免产生焦糖又保证过滤，中和为沉淀胶体）。4、脱色：活性炭脱色和脱色树脂。活性炭用量为0.6-0.8，在70及酸性条件下搅拌后过滤。,4 谷氨酸生产工艺,淀粉的酶法糖化工艺 以大米或碎米为原料时采用大米浸泡磨浆，再调成15Bx，pH 6.0，加细菌-淀粉酶在85 下液化30 min，加糖化酶60 糖化24 h，过滤后可供配制培养基。,4 谷氨酸生产工艺,糖蜜原料 不宜直接用来作为谷氨酸发酵的碳源，因含丰富的生物素。预处理方法：活性炭或树脂吸附和亚硝酸法破坏以减少糖蜜中的生物素。也可以在发酵液中加入表

14、面活性剂吐温60或添加青霉素。,4 谷氨酸生产工艺,菌种扩大培养 1、斜面培养：主要产生菌是棒状杆菌属、短杆菌属、小杆菌属、节杆菌属。我国各工厂目前使用的菌株主要是钝齿棒杆菌和北京棒杆菌及各种诱变株。生长特点：适用于糖质原料，需氧，以生物素为生长因子。斜面培养基：蛋白胨、牛肉膏、氯化钠组成的pH 7.0-7.2琼脂培养基，32 培养18-24 h。,4 谷氨酸生产工艺,菌种扩大培养 2、一级种子培养：由葡萄糖、玉米浆、尿素、磷酸氢二钾、硫酸镁、硫酸铁及硫酸锰组成。pH 6.56.8。1000ml装200-250ml振荡，32 培养12h。,4 谷氨酸生产工艺,菌种扩大培养 3、二级种子培养：用

15、种子罐培养，料液量为发酵罐投料体积的1，用水解糖代替葡萄糖，于32 进行通气搅拌7-10h。种子质量要求：二级种子培养结束时，无杂菌或噬菌体污染，菌体大小均一，呈单个或八字排列。活菌数为108-109/ml。,4 谷氨酸生产工艺,谷氨酸发酵 1、适应期：尿素分解出氨使pH上升。糖不利用。2-4h。措施：接种量和发酵条件控制使该期缩短。2、对数生长期：糖耗快，尿素大量分解使pH上升，氨被利用pH又迅速下降；溶氧急剧下降后维持在一定水平；菌体浓度迅速增大，菌体形态为排列整齐的八字形；不产酸；12h。措施：采取流加尿素办法及时供给菌体生长必须的氮源及调节pH在7.5-8.0；维持温度30-32,4

16、谷氨酸生产工艺,谷氨酸发酵 3、菌体生长停止期：谷氨酸合成，糖和尿素分解产生-酮戊二酸和氨用于合成谷氨酸。措施：及时流加尿素以提供足够的氨并使pH维持在7.2-7.4。大量通气，控制温度34-37。4、发酵后期：菌体衰老，糖耗慢，残糖低。措施：营养物耗尽酸浓度不增加时，及时放罐。发酵周期一般为30h。,4 谷氨酸生产工艺,谷氨酸发酵控制（1）生物素：作为催化脂肪酸生物合成最初反应的关键酶乙酰CoA的辅酶，参与脂肪酸的生物合成，进而影响磷酯的合成。当磷酯含量减少到正常时的一半左右时，细胞发生变形，谷氨酸能够从胞内渗出，积累于发酵液中。生物素过量，则发酵过程菌体大量繁殖，不产或少产谷氨酸，代谢产物

17、中乳酸和琥珀酸明显增多,4 谷氨酸生产工艺,谷氨酸发酵控制（2）种龄和种量的控制 一级种子控制在11-12h，二级控制在7-8h。接种量为1。过多，菌体娇嫩，不强壮，提前衰老自溶，后期产酸量不高。,4 谷氨酸生产工艺,谷氨酸发酵控制（3）pH 发酵前期，幼龄细胞对pH较敏感，pH过低，菌体生长旺盛，营养成分消耗大，转入正常发酵慢，长菌不长酸。谷氨酸脱氢酶最适pH为7.0-7.2，转氨酶最适pH 7.2-7.4。在发酵中后期，保持pH不变。过高转为谷氨酰胺，过低氨离子不足,4 谷氨酸生产工艺,谷氨酸发酵控制（4）通风：不同种龄、种量，培养基成分，发酵阶段及发酵罐大小要求通风量不同。在长菌体阶段，

18、通风量过大，生物素缺乏，抑制菌体生长。在发酵产酸阶段，需要大量通风供氧，以防过量生成乳酸和琥珀酸，但过大通风，则大量积累a-酮戊二酸。,4 谷氨酸生产工艺,4 谷氨酸的提取,1、等电点法：操作简单，收率60。周期长，占地面积大。谷氨酸等电点pH 3.22。谷氨酸晶体有两种，分别为-型和-型。-型晶体轴长接近，晶体粗壮，颗粒大，易分离；-型晶体长短不一，针壮或鳞片壮，晶粒细，不易沉淀淅出。操作中应控制条件以利于形成-型晶体。,5 谷氨酸的提取,2、离子交换法：用阳离子交换树脂提取吸附谷氨酸形成的阳离子，再用热碱洗脱，收集相应流分，再加盐酸结晶。收率可达8090。,提取法工艺要点,1.谷氨酸含量：

19、要求谷氨酸含量在4%以上；2.结晶温度与降温速度：温度低于30，降温速度要慢；3.加酸：加酸是为了调节pH，前期加酸要快，后期加酸要慢，直至等电点；4.投晶种与育晶：谷氨酸含量5%，pH 4.0-4.5时投入晶种，投放量为0.2-0.3%；5.搅拌：20-30 r/min。,6 味精生产工艺,谷氨酸制造味精的工艺流程 味精谷氨酸单钠，具有强鲜味，由谷氨酸用适量的碱中和得到，目前已经是人们日常生活中的常用烹调用品，国内消耗量很大。,工艺要点,1.中和：应使谷氨酸单钠盐的量最大，应向谷氨酸溶液中加入Na2CO3，温度控制在65，浓度21-24 oBrix（白利度），pH 6.6-6.8，不超过7.

20、0，否则生成二钠盐；2.中和液的脱色与除铁 生产上要求脱色、除铁后，液体透光率达90%以上，Fe2+浓度低于5mg/L。3.中和液的浓缩和结晶 当溶液浓缩到29.5-30.5 oBrix时，加入晶体，65-70 结晶12-20h。,继续选育突变菌株：转化率高、高生物素含量下保持高产酸、提高原料利用率、拓宽原料来源、简化操作。生物工程新技术应用：DNA重组技术、原生质体融合技术、固定化细胞技术，产量提高了1倍。改进发酵工艺：开拓原料、改进流加工艺、计算机控制。,7 谷氨酸发酵研究新进展,概述赖氨酸：L-2,6-二氨基己酸，为人体必需的八种氨基酸之一。菌种：谷氨酸棒杆菌的高丝氨酸缺陷型变异株，抗赖

21、氨酸结构类似物、抗苏氨酸结构类似物。生产方法：原用提取法、化学合成法、酶法，自1960年日本直接发酵成功后现在已经是主要方法。,8 赖氨酸生产工艺简介,赖氨酸的发酵控制氨基酸控制：苏氨酸和蛋氨酸是赖氨酸产生菌的生长因子。该菌缺乏蛋白质分解酶，有机氮源需经水解后才能使用。生物素：赖氨酸生产菌大多是生物素缺陷型，限量的生物素有利于谷氨酸积累，大量的生物素抑制谷氨酸生成，增加天冬氨酸，提高赖氨酸产量。,8 赖氨酸生产工艺简介,O-琥珀酸高丝氨酸,天冬氨酸,天冬氨酰磷酸,天冬氨酸-半醛,高丝氨酸,二氢吡啶-2,6-二羧酸,赖氨酸,高丝氨酸磷酸,苏氨酸,蛋氨酸,异亮氨酸,优先合成,反馈抑制,阻遏,赖氨酸

22、的发酵控制赖氨酸发酵的工艺条件：温度：前期32，中后期34。pH：6.57.5，最适6.57.0。pH控制：流加尿素或氨水。种龄和接种量：对数生长期种子；二级种子接种量2，种龄一般为812h；三级种子种量10，种龄68h。供氧：充足。,8 赖氨酸生产工艺简介,赖氨酸的提取与精制发酵液预处理：离心分离或沉淀去除菌体。离子交换法提取赖氨酸：赖氨酸等电点9.59，pH 2.0左右用强酸性阳离子树脂交换，pH 7.09.0间用弱酸性阳离子树脂交换。采用铵型树脂，对碱性氨基酸能选择性交换，用氨水洗脱，不必再生和转型。精制：离交柱洗脱液中含游离氨基酸和氢氧化铵，真空蒸发去氨，用盐酸成盐，结晶，分离，干燥。,8 赖氨酸生产工艺简介,