第01章蛋白质.ppt

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1、蛋白质的结构与功能,第 二 章,Structure and Function of Protein,一、什么是蛋白质?,蛋白质(protein)是由许多氨基酸(amino acids)通过肽键(peptide bond)相连形成的高分子含氮化合物。,二、蛋白质的生物学意义,1.蛋白质是生物体重要组成成分分布广：所有器官、组织都含有蛋白质；细胞的各个部分都含有蛋白质。含量高：蛋白质是细胞内最丰富的有机分子，占人体干重的45，某些组织含量更高，例如脾、肺及横纹肌等高达80。,蛋白质占干重 人体中（中年人）人体 45%水55%细菌 50%80%蛋白质19%真菌 14%52%脂肪19%酵母菌 14%5

2、0%糖类1%白地菌 50%无机盐7%,1）作为生物催化剂（酶）2）代谢调节作用3）免疫保护作用4）物质的转运和存储5）运动与支持作用6）参与细胞间信息传递7)有机体的组成部分8)凝血,2.蛋白质具有重要的生物学功能,蛋白质是生命的 物质基础,三、蛋白质研究的意义,蛋白质技术是现在生物工程的热门技术：蛋白质表达分离纯化抗体特别是单克隆抗体的筛选研究蛋白质药物设计和生产氨基酸发酵营养保健品,蛋 白 质 的 分 子 组 成The Molecular Component of Protein,第 一 节,一、组成蛋白质的元素,主要有C、H、O、N和少量S。有些蛋白质含有少量磷或金属元素铁、铜、锌、锰、

3、钴、钼，个别蛋白质还含有碘。,蛋白质的元素组成,碳 50氢 7氧 23氮 16%硫 03其它 微 量,各种蛋白质的含氮量很接近，平均为16。,由于体内的含氮物质以蛋白质为主，因此，只要测定生物样品中的含氮量，就可以根据以下公式推算出蛋白质的大致含量：,100克样品中蛋白质的含量=每克样品含氮克数 6.25100,16%,蛋白质元素组成的特点,凯氏定氮法,二、氨基酸 组成蛋白质的基本单位,存在自然界中的氨基酸有300余种，但组成人体蛋白质的氨基酸仅有20种，且均属 L-氨基酸（甘氨酸除外）。,（一）氨基酸的功能,作为寡肽、多肽和蛋白质的组成单位；作为多种生物活性物质的前体；作为神经递质；氧化分解

4、产生ATP；作为糖异生的前体；作为营养物质。,（二）氨基酸的结构通式,氨基酸是蛋白质水解的最终产物，是组成蛋白质的基本单位。从蛋白质水解物中分离出来的氨基酸有二十种，除脯氨酸和羟脯氨酸外，这些天然氨基酸在结构上的共同特点为：,(1).与羧基相邻的-碳原子上都有一个氨基，因而称为-氨基酸(2).除甘氨酸外,其它所有氨基酸分子中的-碳原子都为不对称碳原子,所以：A.氨基酸都具有旋光性。B.每一种氨基酸都具有D-型和L-型两种立体异构体。目前已知的天然蛋白质中氨基酸都为L-型。,（三）常见氨基酸的分类,中性AA（1）按R基团的酸碱性分 酸性AA 碱性AA 疏水性R基团AA（2）按R基团的电性质分 电

5、荷极性R基团的AA 带电荷R基团的AA,脂肪族A（3）按R基团的化学结构分 芳香族AA 杂环族AA,非极性氨基酸极性中性氨基酸酸性氨基酸碱性氨基酸,（四）氨基酸的分类,*20种氨基酸的英文名称、缩写符号及分类如下:,天冬氨酸 aspartic acid Asp D 2.97,谷氨酸 glutamic acid Glu E 3.22,赖氨酸 lysine Lys K 9.74,精氨酸 arginine Arg R 10.76,组氨酸 histidine His H 7.59,1.酸性氨基酸,2.碱性氨基酸,甘氨酸 glycine Gly G 5.97,丙氨酸 alanine Ala A 6.00

6、,缬氨酸 valine Val V 5.96,亮氨酸 leucine Leu L 5.98,异亮氨酸 isoleucine Ile I 6.02,苯丙氨酸 phenylalanine Phe F 5.48,脯氨酸 proline Pro P 6.30,3.非极性疏水性氨基酸,色氨酸 tryptophan Trp W 5.89,丝氨酸 serine Ser S 5.68,酪氨酸 tyrosine Tyr Y 5.66,半胱氨酸 cysteine Cys C 5.07,蛋氨酸 methionine Met M 5.74,天冬酰胺 asparagine Asn N 5.41,谷氨酰胺 glutami

7、ne Gln Q 5.65,苏氨酸 threonine Thr T 5.60,4.极性中性氨基酸,几种特殊氨基酸,脯氨酸（亚氨基酸）,半胱氨酸,胱氨酸,人体所需的八种必需氨基酸 赖氨酸(Lys)缬氨酸(Val)蛋氨酸(Met)色氨酸(Try)亮氨酸(Leu)异亮氨酸(Ile)苏氨酸(Thr)苯丙氨酸(Phe)婴儿时期所需:精氨酸(Arg)、组氨酸(His)早产儿所需：色氨酸(Try)、半胱氨酸(Cys),几种重要的不常见氨基酸在少数蛋白质中分离出一些不常见的氨基酸，通常称为不常见蛋白质氨基酸。这些氨基酸都是由相应的基本氨基酸衍生而来的。其中重要的有4-羟基脯氨酸、5-羟基赖氨酸、N-甲基赖氨酸

8、、和3,5-二碘酪氨酸等。这些不常见蛋白质氨基酸的结构如下:,（三）氨基酸的重要理化性质,1.一般物理性质,-氨基酸为无色晶体，熔点极高(一般在200以上)。有的无味、有的味甜、有的味苦、谷氨酸的单钠盐有鲜味(味精的主要成分)。,2.氨基酸的光学性质旋光性紫外吸收,紫外吸收,构成蛋白质的20种氨基酸在可见光区都没有光吸收，但在远紫外区(220nm)均有光吸收。在近紫外区(220-300nm)只有酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸有吸收光的能力。,大多数蛋白质含有这三种氨基酸残基，所以测定蛋白质溶液280nm的光吸收值是分析溶液中蛋白质含量的快速简便的方法。,芳香族氨基酸的紫外吸收,3.两性解离及等电点,

9、氨基酸是两性电解质，其解离程度取决于溶液的酸碱度。,等电点(isoelectric point,pI)在某一pH的溶液中，氨基酸解离成阳离子和阴离子的趋势及程度相等，成为兼性离子，呈电中性。此时溶液的pH值称为该氨基酸的等电点。,pHpI,氨基酸的兼性离子,阴离子,阳离子,pHpI,应用：分离制备氨基酸,A.等电点时，氨基酸的溶解度最小，易沉淀。利用该性质可分离制备某些氨基酸。例如谷氨酸的生产，即将微生物发酵液的pH值调至3.22（谷氨酸的等电点）而使谷氨酸沉淀析出。B.利用各种氨基酸的等电点不同，可通过电泳法、离子交换法等在实验室或工业生产上进行混合氨基酸的分离或制备。氨基酸的等电点可由其分

10、子上解离基团的解离常数来确定。,（2）等电点理论的应用,（3）氨基酸等电点的计算,可见，氨基酸的pI值等于该氨基酸的两性离子两侧的基团pK值之和的二分之一。,氨基酸是离子化合物，但在溶液状态时，存在 下列平衡：,化学反应中可用左边的结构式表示氨基酸。,氨基酸分子的-氨基、-羧基均能参加反应，有的侧链R基团也能参加反应。,4、氨基酸氨基和羧基参与的化学反应,与亚硝酸的反应,在标准条件下测定生成的N2体积，即可计算出氨基酸的量。,用途：是范斯莱克（Van Slyke）法测定氨基氮的基础,可用于氨基酸定量和蛋白质水解程度的测定,室 温,（1）-氨基参加的反应,与甲醛的反应,用NaOH滴定,氨基酸甲醛

11、滴定法(概念),判断蛋白质水解或合成的进度,与2,4-二硝基氟苯（DNFB）的反应 烃基化反应,2，4-二硝基苯氨基酸，黄色（DNP-氨基酸，可用乙酸乙酯或乙醚抽提）,多肽或蛋白质N端氨基酸的-氨基也能与DNFB反应，生成DNP-多肽或DNP-蛋白质。后者用酸水解时，所有肽键被打开，可得到黄色的DNP-氨基酸。该反应由F.Sanger（英）首先发现，并用于鉴定多肽或蛋白质的N-端氨基酸，阐明了胰岛素的一级结构。（故DNFB亦称作Sanger试剂）蛋白质N端氨基酸测定的方法之一,5-二甲氨基萘磺酰氯(简称丹磺酰氯或DNS-Cl)代替DNFB试剂,5-二甲氨基萘磺酰氨基酸有强烈的荧光，可用荧光光度

12、计快速检出，灵敏度高。,酰化试剂,苯氨基硫甲酰氨基酸(PTC-氨基酸，无色),苯硫乙内酰脲氨基酸(PTH-氨基酸,无色,可用乙酸乙酯抽提),与异硫氰酸苯酯(PITC)的反应烃基化反应,Edman（瑞典）首先使用该反应鉴定多肽或蛋白质的N-端氨基酸。蛋白质多肽链N端氨基酸的-氨基可与PITC反应生成 PTC-蛋白质,在酸性溶液中，它释放出未端的 PTH-氨基酸和比原来少了一个氨基酸残基的多肽链称为Edman降解反应。（故PITC亦称作Edman试剂）。该反应在多肽和蛋白质的氨基酸序列分析方面占有重要地位多肽顺序自动分析仪，一次可连续测出60个以上的氨基酸顺序。,（2）-羧基参加的反应,成盐和成酯

13、反应,该反应使氨基酸的氨基被活化,氨基酸与碱作用即生成盐。氨基酸的羧基被醇酯化，形成相应的酯。,脱羧基反应,蛋白质合成的氨基酸活化反应,（3）-氨基和-羧基参加的反应,与茚三酮的反应,茚三酮 水合茚三酮,+,水合茚三酮(无色),水合茚三酮,脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应产生黄色物质，其余所有的-氨基酸与茚三酮反应均产生蓝紫色物质。,黄色，max=440nm,成肽反应缩合反应,这是多肽和蛋白质生物合成的基本反应,三、肽,肽键(peptide bond)是由一个氨基酸的-羧基与另一个氨基酸的-氨基脱水缩合而形成的化学键。,（一）肽(peptide),蛋白质是由一条或多条多肽(polypeptide)

14、链以特殊方式结合而成的生物大分子。蛋白质与多肽并无严格的界线，通常是将分子量在6000道尔顿以上的多肽称为蛋白质。蛋白质分子量变化范围很大,从大约6000到1000000道尔顿甚至更大,+,甘氨酰甘氨酸,肽键,*肽是由氨基酸通过肽键缩合而形成的化合物。,*两分子氨基酸缩合形成二肽，三分子氨基酸缩合则形成三肽,*肽链中的氨基酸分子因为脱水缩合而基团不全，被称为氨基酸残基(residue)。,*由十个以内氨基酸相连而成的肽称为寡肽(oligopeptide)，由更多的氨基酸相连形成的肽称多肽(polypeptide)。,*主链和侧链,N 末端：多肽链中有自由氨基的一端C 末端：多肽链中有自由羧基的

15、一端,多肽链有两端,*多肽链(polypeptide chain)是指许多氨基酸之间以肽键连接而成的一种结构。,N末端,C末端,牛核糖核酸酶,（二）几种生物活性肽,1.谷胱甘肽(glutathione,GSH),GSH过氧化物酶,GSH还原酶,NADPH+H+,NADP+,体内许多激素属寡肽或多肽,神经肽(neuropeptide),2.多肽类激素及神经肽,+H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-COO-+H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-COO-Met-脑啡肽 Leu-脑啡肽,蛋白质的分子结构The Molecular Structure of Protein,第 二

16、 节,蛋白质的分子结构包括 一级结构(primary structure)二级结构(secondary structure)三级结构(tertiary structure)四级结构(quaternary structure),定义蛋白质的一级结构指多肽链中氨基酸的排列顺序。,一、蛋白质的一级结构(Primary structure）,主要的化学键肽键，有些蛋白质还包括二硫键。,一级结构是蛋白质空间构象和特异生物学功能的基础。,一级结构的测定,(1)测定蛋白质的一级结构的要求A.样品必需纯（97%以上）；B.知道蛋白质的分子量；C.知道蛋白质由几个亚基组成；D.测定蛋白质的氨基酸组成；并根据分子

17、量计算每种氨基酸的个数。E.测定水解液中的氨量，计算酰胺的含量。(2)测定步骤多肽链的拆分：测定蛋白质分子中多肽链的数目：二硫键的断裂：测定每条多肽链的氨基酸组成，并计算出氨基酸成分的分子比分析多肽链的N-末端和C-末端多肽链断裂成多个肽段测定每个肽段的氨基酸顺序。确定肽段在多肽链中的次序确定原多肽链中二硫键的位置：,二、蛋白质的二级结构,主要的化学键：氢键,（一）肽单元,参与肽键的6个原子C1、C、O、N、H、C2位于同一平面，称为肽平面。C1和C2在平面上所处的位置为反式(trans)构型，此同一平面上的6个原子构成了所谓的肽单元(peptide unit)。,(二）主链构象的分子模型,-

18、螺旋(-helix)-折叠(-pleated sheet)-转角(-turn)无规卷曲(random coil),1.-螺旋,左手和右手螺旋,在-螺旋中肽平面的键长和键角一定,肽键的原子排列呈反式构型,相邻的肽平面构成两面角.多肽链中的各个肽平面围绕同一轴旋转，形成螺旋结构，螺旋一周，沿轴上升的距离即螺距为0.54nm,含3.6个氨基酸残基；两个氨基酸之间的距离0.15nm.蛋白质分子为右手-螺旋。肽链内形成氢键，氢键的取向几乎与轴平行，第一个氨基酸残基的酰胺基团的-CO基与第四个氨基酸残基酰胺基团的-NH基形成氢键。侧链：氨基酸残基的侧链分布在螺旋外侧，其形状、大小及电荷等均会影响螺旋的形成

19、和稳定性。,1.-螺旋,2.-折叠,在-折叠中，-碳原子总是处于折叠的角上，氨基酸的R基团处于折叠的棱角上并与棱角垂直，两个氨基酸之间的轴心距为0.35nm.-折叠结构的氢键主要是由两条肽链之间形成的；也可以在同一肽链的不同部分之间形成。几乎所有肽键都参与链内氢键的交联，氢键与链的长轴接近垂直。-折叠有两种类型。一种为平行式，即所有肽链的N-端都在同一边。另一种为反平行式，即相邻两条肽链的方向相反。,3.-转角,-转角,在-转角部分，由四个氨基酸残基组成.四个形成转角的残基中，第三个一般均为甘氨酸残基弯曲处的第一个氨基酸残基的-C=O 和第四个残基的 N-H 之间形成氢键，形成一个不很稳定的环

20、状结构。这类结构主要存在于球状蛋白分子中。,4.无规卷曲,没有一定规律的松散肽链结构，但仍是紧密有序的稳定结构，通过主链间及主链与侧链间氢键维持其构象不同的蛋白质，自由回转的数量和形式各不相同分两类：紧密环 连接条带,（）超二级结构在蛋白质分子中，由若干相邻的二级结构单元组合在一起，彼此相互作用，形成有规则的、在空间上能辨认的二级结构组合体。几种类型的超二级结构：；超二级结构在结构层次上高于二级结构，但没有聚集成具有功能的结构域,（三）超二级结构和结构域,对于较大的蛋白质分子或亚基，多肽链往往由两个或两个以上相对独立的三维实体缔合而成三级结构。这种相对独立的三维实体就称结构域。结构域通常是几个

21、超二级结构的组合，对于较小的蛋白质分子，结构域与三级结构等同，即这些蛋白为单结构域。结构域一般由100200个氨基酸残基组成，但大小范围可达40400 个残基。氨基酸可以是连续的，也可以是不连续的结构域之间常形成裂隙，比较松散，往往是蛋白质优先被水解的部位。酶的活性中心往往位于两个结构域的界面上结构域之间由“铰链区”相连，使分子构象有一定的柔性，通过结构域之间的相对运动，使蛋白质分子实现一定的生物功能。在蛋白质分子内，结构域可作为结构单位进行相对独立的运动，水解出来后仍能维持稳定的结构，甚至保留某些生物活性,（）结构域,钙结合蛋白中结合钙离子的结构域,锌指结构,氨基酸残基的侧链对二级结构形成的

22、影响,蛋白质二级结构是以一级结构为基础的。一段肽链其氨基酸残基的侧链适合形成-螺旋或-折叠，它就会出现相应的二级结构。,三、蛋白质的三级结构,整条肽链中全部氨基酸残基的相对空间位置。即肽链中所有原子在三维空间的排布位置。,（一）定义,肌红蛋白(Mb),（三）分子伴侣,分子伴侣(chaperon)通过提供一个保护环境从而加速蛋白质折叠成天然构象或形成四级结构。,*分子伴侣可逆地与未折叠肽段的疏水部分结合随后松开，如此重复进行可防止错误的聚集发生，使肽链正确折叠。,*分子伴侣也可与错误聚集的肽段结合，使之解聚后，再诱导其正确折叠。,*分子伴侣在蛋白质分子折叠过程中二硫键的正确形成起了重要的作用。,

23、亚基之间的结合力主要是疏水作用，其次是氢键和离子键。,四、蛋白质的四级结构,蛋白质分子中各亚基的空间排布及亚基接触部位的布局和相互作用，称为蛋白质的四级结构。,有些蛋白质分子含有二条或多条多肽链，每一条多肽链都有完整的三级结构，称为蛋白质的亚基(subunit)。,血红蛋白的四级结构,一级结构二级结构超二级结构结构域三级结构亚基四级结构,蛋白质分子中的共价键与次级键,蛋白质结构与功能的关系The Relationship between Structure and Function of Protein,第 三 节,（一）一级结构是空间构象的基础,一、蛋白质一级结构与功能的关系,天然状态，有催

24、化活性,尿素、-巯基乙醇,去除尿素、-巯基乙醇,非折叠状态，无活性,（二）一级结构与功能的关系,蛋白质一级结构不同，生物学功能各异一级结构关键部位影响其生物学活性一级结构变化与分子病,例：镰刀形红细胞贫血,这种由蛋白质分子发生变异所导致的疾病，称为“分子病”。,（一）蛋白质的激活 体内的某些蛋白质分子初合成时，常带有抑制肽，呈无活性状态，称为蛋白质原.蛋白质原的部分肽链以特定的方式断裂后，才变为活性分子.例：胰岛素，在刚合成时，是一个比成熟的胰岛素分子大一倍多的单链多肽，称为前胰岛素原前胰岛素原的N-末端有一段肽链，称为信号肽.信号肽被切去，剩下的是胰岛素原。胰岛素原比胰岛素分子多一段C肽，只

25、有当C肽被切除后才成为有51个残基，分A、B两条链的胰岛素分子单体.,二、蛋白质空间结构与功能的关系,Hb与Mb一样能可逆地与O2结合，Hb与O2结合后称为氧合Hb。氧合Hb占总Hb的百分数（称百分饱和度）随O2浓度变化而改变。,（二）蛋白质的变构作用,（一）肌红蛋白与血红蛋白的结构,肌红蛋白(Mb)和血红蛋白(Hb)的氧解离曲线,*协同效应(cooperativity),一个寡聚体蛋白质的一个亚基与其配体结合后，能影响此寡聚体中另一个亚基与配体结合能力的现象，称为协同效应。如果是促进作用则称为正协同效应(positive cooperativity)如果是抑制作用则称为负协同效应(negat

26、ive cooperativity),序变模型,齐变模型,血红素与氧结合后，铁原子半径变小，就能进入卟啉环的小孔中，继而引起肽链位置的变动。,变构效应(allosteric effect),蛋白质空间结构的改变伴随其功能的变化，称为变构效应。,（三）蛋白质的正确折叠与蛋白伴侣,蛋白伴侣（分子伴侣）的概念：,第四节,蛋白质的理化性质The Physical and Chemical Characters of Protein,一、蛋白质的两性电离,蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，氨基酸残基侧链中某些基团，在一定的溶液pH条件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。,*蛋白质的等电点(isoel

27、ectric point,pI)当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的pH称为蛋白质的等电点。,二、蛋白质的胶体性质,蛋白质属于生物大分子之一，分子量可自1万至100万之巨，其分子的直径可达1100nm，为胶粒范围之内。,*蛋白质胶体稳定的因素颗粒表面电荷水化膜,水化膜,溶液中蛋白质的聚沉,三、蛋白质的变性、复性及沉淀,*蛋白质的变性(denaturation)在某些物理和化学因素作用下，其特定的空间构象被破坏，也即有序的空间结构变成无序的空间结构，从而导致其理化性质改变和生物活性的丧失。,造成变性的因素如加热、乙醇等有机溶剂、强酸

28、、强碱、重金属离子及生物碱试剂等。,应用举例临床医学上，变性因素常被应用来消毒及灭菌。此外,防止蛋白质变性也是有效保存蛋白质制剂（如疫苗等）的必要条件。,若蛋白质变性程度较轻，去除变性因素后，蛋白质仍可恢复或部分恢复其原有的构象和功能，称为复性(renaturation)。,天然状态，有催化活性,尿素、-巯基乙醇,去除尿素、-巯基乙醇,非折叠状态，无活性,蛋白质沉淀在一定条件下，蛋白疏水侧链暴露在外，肽链融会相互缠绕继而聚集，因而从溶液中析出。变性的蛋白质易于沉淀，有时蛋白质发生沉淀，但并不变性。,蛋白质的凝固作用(protein coagulation)蛋白质变性后的絮状物加热可变成比较坚固

29、的凝块，此凝块不易再溶于强酸和强碱中。,四、蛋白质的紫外吸收,由于蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸，因此在280nm波长处有特征性吸收峰。蛋白质的OD280与其浓度呈正比关系，因此可作蛋白质定量测定。,五、蛋白质的呈色反应,茚三酮反应(ninhydrin reaction)蛋白质经水解后产生的氨基酸也可发生茚三酮反应。,双缩脲反应(biuret reaction)蛋白质和多肽分子中肽键在稀碱溶液中与硫酸铜共热，呈现紫色或红色，此反应称为双缩脲反应，双缩脲反应可用来检测蛋白质水解程度。,米伦氏反应酪氨酸的显色反应（酚羟基反应）米伦试剂为硝酸、亚硝酸、硝酸汞、亚硝酸汞的混合物蛋白

30、溶液中，加入米伦试剂，产生白色沉淀，加热后变成红色乙醛酸反应在蛋白质溶液中加入HCOCOOH，将浓硫酸沿管壁缓慢加入，不使相混，在液面交界处，即有紫色环形成色氨酸的反应（吲哚环的反应）鉴定蛋白质中是否含有色氨酸明胶中不含色氨酸坂口反应精氨酸的反应（胍基的反应）精氨酸与-萘酚在碱性次氯酸钠（或次溴酸钠）溶液中发生反应，产生红色产物鉴定蛋白质中是否含有精氨酸定量测定精氨酸,福林试剂反应酪氨酸、色氨酸的反应（还原反应）福林试剂：磷钼酸-磷钨酸 与双缩脲法结合-Lowry法在碱性条件下，蛋白质与硫酸铜发生反应蛋白质-铜络合物，将福林试剂还原，产生磷钼蓝和磷钨蓝混合物灵敏度提高100倍茚三酮反应灵敏度差

31、黄蛋白反应浓硝酸与酪氨酸、色氨酸的反应生成黄色化合物指甲、皮肤、毛发考马斯亮蓝G-250本身为红色，与蛋白质反应呈蓝色与蛋白的亲和力强，灵敏度高1-1000微克/毫升,1.根据化学成分测定最小相对分子质量 此法首先利用化学分析方法测定蛋白质分子中某一特殊成分的百分含量然后，假定蛋白质分子中该成分只有一个，据其百分含量可计算出最低相对分子质量：最小相对分子质量（已知成分的相对分子、原子质量）/已知成分的百分含量如果蛋白质分子中所含已知成分不是一个单位，则真实相对分子质量等于最小相对分子质量的倍数。2.超离心法在60 00080 000r/min的高速离心力作用下，蛋白质分子会沿旋转中心向外周方向

32、移动用光学方法测定界面移动的速度即为蛋白质的离心沉降速度蛋白质的沉降速度与分子大小和形状有关,蛋白质相对分子质量的测定方法,沉降系数是溶质颗粒在单位离心场中的沉降速度，用S表示。一个S单位，为110-13秒相对分子质量越大，S值越大蛋白质的沉降系数：1200S 由沉降系数S可根据斯维得贝格Svedberg方程计算蛋白质分子的相对分子质量：M=RST/D1i R：气体常数 T：绝对温度 D：扩散系数：溶剂的密度3.凝胶过滤法凝胶过滤所用介质为凝胶珠，其内部为多孔网状结构一定型号的凝胶网孔大小一定，只允许相应大小的分子进入凝胶颗粒内部，大分子则被排阻在外洗脱时大分子随洗脱液从颗粒间隙流下来，洗脱液

33、体积小；小分子在颗粒网状结构中穿来穿去，历程长，后洗脱下来，洗脱体积大测定蛋白质分子量一般用葡聚糖，商品名：Sephadex,测得几种标准蛋白质的洗脱体积Ve以相对分子质量对数（logM）对Ve作图，得标准曲线再测出未知样品洗脱体积Ve从标准曲线上可查出样品蛋白质的相对分子质量,4.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法SDS:十二烷基硫酸钠，变性剂普通蛋白质电泳的泳动速率取决于荷质比（净电荷、大小、形状）用SDS和巯基乙醇（打开二硫键）处理蛋白质变性（肽链伸展）并与SDS结合，形成SDS-蛋白质复合物不同蛋白质分子的均负电（SDS带负电）；且荷质比相同（蛋白质分子大，结合SDS多；分子小，结合SDS少

34、）不同蛋白质分子具有相似的构象用几种标准蛋白质相对分子质量的对数值对它们的迁移率作图测出待测样品的迁移率从标准曲线上查出样品的相对分子质量,影响迁移率的主要因素凝胶的分子筛效应对长短不同的棒形分子会 产 生不同的阻力主要因素凝胶的浓度和交联度同一电泳条件下，分子小，受阻小，游动快，迁移率大。相对分子质量大者，迁移率小 优点：快速，样品用量少，可同时测几个样品 缺点：误差大，约为10（误差主要来源于迁移距离的测量误差）此方法只能测得 亚基肽链的相对分子质量二.蛋白质的两性离解和电泳现象蛋白质与多肽一样，能够发生两性离解，也有等电点。在等电点时(Isoelectric point pI)，蛋白质的

35、溶解度最小，在电场中不移动。在不同的pH环境下，蛋白质的电学性质不同。在等电点偏酸性溶液中，蛋白质粒子带负电荷，在电场中向正极移动；在等电点偏碱性溶液中，蛋白质粒子带正电荷，在电场中向负极移动。这种现象称为蛋白质电泳(Electrophoresis)。,蛋白质在等电点pH条件下，不发生电泳现象。利用蛋白质的电泳现象，可以将蛋白质进行分离纯化。,三.蛋白质的胶体性质由于蛋白质的分子量很大，它在水中能够形成胶体溶液。蛋白质溶液具有胶体溶液的典型性质，如丁达尔现象、布郎运动等。由于胶体溶液中的蛋白质不能通过半透膜，因此可以应用透析法将非蛋白的小分子杂质除去。,新年皮划比赛正式开始，在大家面前的是最新的聚丙烯酰胺赛道，由经验丰富的SDS裁判统一每位运动员的赛艇的形状和尺寸。现在有请运动员入场（进样），过预备赛道（积层胶）后并排于起跑线上，随即，信号枪响起，所有运动员（样品）进入赛道（分离胶），在加油的呐喊声中，第N道率先到达终点（溴酚蓝前沿指示剂到达分离胶底部），比赛结束。,