第02章核酸.ppt

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1、第 2 章 核酸的结构和功能,核酸是一类重要的生物大分子，担负着生命信息的储存与传递。核酸是现代生物化学、分子生物学的重要研究领域，是基因工程操作的核心分子。,第一节 核酸的概念,核 酸(nucleic acid)的概念,1、功能-核酸是生物遗传的物质基础，决定生物的生长、繁殖以及生命的代谢模式。2、结构-是以核苷酸为基本组成单位的生物大分子，携带和传递遗传信息。3、DNA储存信息；RNA传递并表达信息4、DNA-RNA-蛋白质,一、核酸的发现和研究工作进展,1868年 Fridrich Miescher从脓细胞中提取含磷丰富的酸性物质-“核素”1944年 Avery等人证实DNA是遗传物质2

2、0世纪50年代初，Erwin Chargaff在测定多种生物的DNA组成后，发现A=T,G=C,这称为“Chargaff定则”1953年 Watson和Crick发现DNA的双螺旋结构1968年 Nirenberg发现遗传密码1975年 Temin和Baltimore发现逆转录酶1981年 Gilbert和Sanger建立DNA 测序方法1985年 Mullis发明PCR 技术1990年 美国启动人类基因组计划(HGP)1994年 中国人类基因组计划启动1998年，国际水稻基因组计划，2000年5月，中国超级杂交水稻基因组计划 2001年 美、英等国完成人类基因组计划基本框架，2003年完成精

3、细图谱,二、核酸的分类及分布,第二节 核酸的组成成分,核酸的化学组成,1.元素组成C、H、O、N、P（910%）,2.分子组成,核酸,核苷酸,核苷,磷酸,碱基,戊糖,A G,C U T,一、戊 糖,嘌呤(purine),腺嘌呤(adenine,A),鸟嘌呤(guanine,G),二、碱 基,嘧啶(pyrimidine),胞嘧啶(cytosine,C),尿嘧啶(uracil,U),胸腺嘧啶(thymine,T),核酸中也存在一些不常见的稀有碱基。稀有碱基的种类很多，大部分是上述碱基的甲基化产物。,核苷：AR,GR,UR,CR脱氧核苷：dAR,dGR,dTR,dCR,核苷酸：AMP,GMP,UMP

4、,CMP脱氧核苷酸：dAMP,dGMP,dTMP,dCMP,体内重要的游离核苷酸及其衍生物,辅酶和辅基含核苷酸的生物活性物质：NAD+、NADP+、CoA-SH、FAD 等都含有 AMP能量载体-ATP、GTP食品工业上用作添加剂,单体多磷酸核苷酸：NMP，NDP，NTP,第二信使环化核苷酸:cAMP，cGMP,AMP,cAMP,C,G,A,一、核酸的一级结构,第三节 核酸的分子结构,5-磷酸端（常用5-P表示）；3-羟基端（常用3-OH表示）多聚核苷酸链具有方向性，当表示一个多聚核苷酸链时，必须注明它的方向是53或是35，一般默认为从左到右为5-3。,多聚核苷酸的表示方式,DNA RNA,5

5、PdAPdCPdGPdTOH 3 5PAPCPGPUOH 或5ACGTGCGT 3 5ACGUAUGU 3 ACGTGCGT ACGUAUGU,DNA一级结构的意义,DNA虽然只是由于四个碱基的变化形成的四种核苷酸按照一定的顺序排列起来，但值得注意的是，DNA的碱基顺序本身就是遗传信息存储的分子形式。生物界物种的多样性即寓于DNA分子中四种核苷酸千变万化的不同排列组合之中。,DNA的二级结构-双螺旋结构DNA双螺旋结构的研究背景和历史意义DNA双螺旋结构模型要点DNA的超螺旋结构及其在染色质中的组装DNA的超螺旋结构原核生物DNA的高级结构DNA在真核生物细胞核内的组装DNA的功能,二、核酸的

6、二级结构,（一）DNA的二级结构双螺旋结构,（一）DNA双螺旋结构的研究背景,（二）DNA双螺旋结构模型要点（Watson,Crick,1953）,两条DNA单链分子反向平行环绕，右手螺旋走向，表面大沟与小沟相间。螺旋直径为2nm，主链：戊糖 磷酸骨架位于外侧 侧链：碱基对位于内侧碱基平面垂直于螺旋轴 碱基距：0.34nm；螺距：3.4nm；周长：10对碱基。,（二）DNA双螺旋结构模型要点（Watson,Crick,1953）,碱基形成氢键配对，配对形式为：A=T;GC）。,碱基互补配对,T,A,C,G,（二）DNA双螺旋结构模型要点（Watson,Crick,1953）,稳定因素：氢键维持

7、横向稳定性 碱基堆积力维持纵向稳定性其他作用因素,4.DNA双螺旋结构的多样性,三种类型DNA的结构参数,5.与DNA碱基序列相关的特殊结构,回文结构发卡结构镜像重复,二、DNA的超螺旋结构及其在染色质中的组装,（一）DNA的超螺旋结构,超螺旋结构(superhelix 或supercoil)DNA双螺旋链再盘绕即形成超螺旋结构。,正超螺旋(positive supercoil)盘绕方向与DNA双螺旋方同相同,负超螺旋(negative supercoil)盘绕方向与DNA双螺旋方向相反,意义DNA超螺旋结构整体或局部的拓扑学变化及其调控对于DNA复制和RNA转录过程具有关键作用。,（二）原核

8、生物DNA的高级结构,（三）DNA在真核生物细胞核内的组装,真核生物染色体由DNA和蛋白质构成，其基本单位是 核小体(nucleosome)。,核小体的化学组成DNA：约200bp 组蛋白：H1,H2A,H2B,H3,H4,染色体的组装过程：核小体 串珠状染色质细丝 中空线圈螺线管 染色单体,压缩了1000-2000倍,多级螺旋模型压缩倍数 7 6 40 5（8400）DNA 核小体 螺线管 超螺线管 染色单体 2nm 10nm 30(10)nm 400nm 210m 一级包装 二级包装 三级包装 四级包装,三、DNA的功能,以基因的形式储存、传递、表达信息 DNA-RNA-蛋白质,基因从结构

9、上定义，是指DNA分子中的特定区段，其中的核苷酸排列顺序决定了基因的功能。,第三节 RNA的结构与功能,Structure and Function of RNA,RNA的种类、分布、功能,一、信使RNA的结构与功能,*真核生物mRNA成熟过程,内含子（intron）,外显子（exon）,*真核生物mRNA结构特点,5末端有甲基化鸟苷帽子结构：m7GpppNm-,2.3末端有多聚腺苷酸尾巴：PolyA。,帽子结构,促进mRNA由胞核向胞质的转位维持mRNA的稳定性翻译起始的调控,帽子结构和多聚A尾的功能,*mRNA的功能 把DNA的碱基序列翻译成蛋白质的氨基酸顺序。,*tRNA的一级结构特点

10、含 1020%稀有碱基 3末端为 CCA-OH 5末端大多数为G 具有 TC环,二、转运RNA的结构与功能,N,N二甲基鸟嘌呤,N6-异戊烯腺嘌呤,双氢尿嘧啶,4-巯尿嘧啶,稀有碱基,*tRNA的二级结构三叶草形 氨基酸臂 DHU环 反密码子环 额外环 TC环,氨基酸臂,额外环,*tRNA的三级结构 倒L形,*tRNA的功能活化、搬运氨基酸到核糖体，参与蛋白质的翻译。,*rRNA的结构,三、核蛋白体RNA的结构与功能,*rRNA的功能参与组成核蛋白体，作为蛋白质生物合成的场所。,rRNA的种类（根据沉降系数）沉降系数：单位时间内的沉降速度,真核生物5S rRNA28S rRNA5.8S rRN

11、A18S rRNA,原核生物5S rRNA23S rRNA16S rRNA,核蛋白体的组成,核 酸 的 理 化 性 质The Physical and Chemical Characters of Nucleic Acid,第 四 节,核酸的酸碱及溶解度性质核酸为多元酸，具有较强的酸性，其中的碱基又具有碱性，所以为两性电解质。可与金属离子成盐，不溶于乙醇或异丙醇。核酸的高分子性质粘度：DNARNA dsDNA ssDNA沉降行为核酸的紫外吸收(OD260)单核苷酸 ssDNA(或RNA)dsDNA核酸的分离方法：电泳-依据分子量大小 离子交换法-依据电荷,一、核酸的一般理化性质,1.DNA或R

12、NA的定量OD260=1.0相当于50g/ml双链DNA40g/ml单链DNA（或RNA）20g/ml寡核苷酸2.判断核酸样品的纯度DNA纯品:OD260/OD280=1.8RNA纯品:OD260/OD280=2.0,OD260的应用,二、DNA的变性(denaturation),定义：在某些理化因素作用下，DNA双链解开成两条单链的过程。,方法：过量酸，碱，加热，变性试剂如尿素、酰胺以及某些有机溶剂如乙醇、丙酮等。,变性后其它理化性质变化：,OD260增高粘度下降比旋度下降浮力密度升高酸碱滴定曲线改变生物活性丧失,DNA变性的本质是双链间氢键的断裂,例：变性引起紫外吸收值的改变,DNA的紫外

13、吸收光谱,增色效应：DNA变性时其溶液OD260增高的现象。,热变性,解链曲线：如果在连续加热DNA的过程中以温度对A260（absorbance，A，A260代表溶液在260nm处的吸光率）值作图，所得的曲线称为解链曲线。,Tm：DNA变性时紫外光吸收值达到最大值的50%时的温度称为DNA的解链温度，又称融解温度(melting temperature,Tm)。影响Tm的因素：大小、G+C含量,三、DNA的复性与分子杂交,DNA复性(renaturation)的定义在适当条件下，变性DNA的两条互补链可恢复天然的双螺旋构象，这一现象称为复性。,减色效应 DNA复性时，其溶液OD260降低的现

14、象。,热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，这一过程称为退火(annealing)。,不同来源的核酸链分子复性时形成杂化双链过程叫分子杂交。这种杂化双链可以在不同的DNA与DNA之间形成，也可以在DNA和RNA分子间或者RNA与RNA分子间形成。这种现象称为核酸分子杂交。,核酸分子杂交(hybridization),核酸分子杂交的应用研究DNA分子中某一种基因的位置确定两种核酸分子间的序列相似性检测某些专一序列在待检样品中存在与 否是基因芯片技术的基础,核 酸 酶 核酸酶是指所有可以水解核酸的酶,核酸酶的分类依据底物不同分类DNA酶(deoxyribonuclease,DNase)：专一降解DN

15、A。RNA酶(ribonuclease,RNase)：专一降解RNA。依据切割部位不同核酸内切酶：分为限制性核酸内切酶和非特异性限制性核酸内切酶。核酸外切酶：53或35核酸外切酶。,参与DNA的合成与修复、RNA合成后的剪接等重要基因复制和基因表达过程 负责清除多余的、结构和功能异常的核酸，同时也可以清除侵入细胞的外源性核酸 在消化液中降解食物中的核酸以利吸收 体外重组DNA技术中的重要工具酶,生物体内的核酸酶负责细胞内外催化核酸的降解,核酸酶的功能,核 酶-有催化活性的RNA,1982年，美国Thomas Cech 在研究四膜虫rRNA自我剪接时发现，同时加拿大的Sidney Altman

16、发现RNase P分子中的RNA组分有催化活性；1989年分享了Noble 化学奖。不仅拓宽了生物催化剂的领域，而且对RNA的生物学功能开创了一种历史性的新认识：RNA不仅具有储存和传递遗传信息的功能，而且还具有生物催化剂的功能，在一定程度上可以说，RNA一身兼有DNA和蛋白质两大类生物大分子的功能。,催化性DNA(DNAzyme)人工合成的寡聚脱氧核苷酸片段，也能序列特异性降解RNA。,催化性RNA(ribozyme)作为序列特异性的核酸内切酶降解mRNA。,核酶的二级结构对于催化活性很重要。Symons提出“锤头”（hammerhead）状二级结构。三个螺旋区；13（或11）个保守核苷酸序

17、列。,核酸的酚抽提,原理：交替使用酚、氯仿两种蛋白质变性剂，更有效去除蛋白质。氯仿还可加速有机相与水相的分层。异戊醇：抑制界面泡沫的形成。标准程序：酚酚-氯仿氯仿。,核酸的沉淀,原理：核酸与钠、钾、镁形成的盐在许多有机溶剂中不溶，也不会变性。醋酸钠为沉淀DNA、RNA的最常用盐类。有机溶剂：乙醇、异丙醇、聚乙二醇。温度：冰水,真核细胞RNA的提取纯化,一个典型的哺乳动物细胞约含10-5g RNA，其中8085%为rRNA，mRNA为细胞总RNA的15%。制备高质量真核细胞RNA的关键是在抽提的最初步骤就需要抑制核糖核酸酶的活性，并避免所用玻璃器皿及液体污染微量核糖核酸酸酶。,创造一个无RNA酶

18、的环境,洁净实验室环境 一次性手套，勤换 环境洁净（避免飞尘中细菌真菌产生外源性RNA酶污染）玻璃和塑料器皿处理 玻璃：常规洗净后，200干烤4小时 塑料：一次性。,溶液配制：加0.1%DEPC371216Hr，高压除去残留的DEPC。不能高压灭菌的溶液，用DEPC处理过的无RNA酶的三蒸水配制，用滤膜过滤除菌。DEPC：焦碳酸二乙酯，是一种强烈但并不彻底的RNA酶抑制剂，通过和RNA酶中His结合使蛋白质变性，抑制RNA酶活性。C2H5-O-CO-O-CO-O-C2H5,抑制内源性RNA酶酶活 异硫氰酸胍：强烈变性剂，能迅速溶解蛋白质，导致细胞结构破碎，使RNA从细胞中释放，又称解偶剂。-巯基乙醇和异硫氰酸胍能使细胞内各种RNA酶失活。十二烷基肌酸钠：可使核糖体蛋白质与RNA分子分离。Rnasin：核糖核酸酶素,是RNA酶的一种非竞争性抑制剂。,