第06章RNA转录与转录后加工.ppt

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1、第 六 章,RNA的转录（生物合成）RNA Biosynthesis,Transcription,参与转录的物质,原料:NTP(ATP,UTP,GTP,CTP)模板:DNA酶:RNA聚合酶(RNA polymerase,RNA-pol)其他蛋白质因子,模板和酶Templates and Enzymes,第一节,一、转录模板,DNA分子上转录出RNA的区段，称为结构基因(structural gene)。DNA双链中按碱基配对规律能指引转录生成RNA的一股单链，称为模板链(template strand)，也称作反意义链或Watson链。相对的另一股单链是编码链(coding strand)，也

2、称为有义链或Crick链。,5GCAGTACATGTC 3,3 c g t g a t g t a c a g 5,5GCAGUACAUGUC 3,NAla Val His Val C,编码链,模板链,mRNA,蛋白质,转录,翻译,53,35,模板链,编码链,编码链,模板链,结构基因,不对称转录(asymmetric transcription),在DNA分子双链上某一区段，一股链用作模板指引转录，另一股链不转录；模板链并非永远在同一条单链上。,二、RNA聚合酶,（一）原核生物的RNA聚合酶,核心酶(core enzyme),全酶(holoenzyme),（二）真核生物的RNA聚合酶,三、模板

3、上酶的辨认、结合,原核生物一个转录区段可视为一个转录单位，称为操纵子(operon)，包括若干个结构基因及其上游(upstream)的调控序列。,RNA聚合酶结合模板DNA的部位，称为启动子(promoter)。,RNA聚合酶全酶在转录起始区的结合,RNA聚合酶保护法,目 录,开始转录,T T G A C AA A C T G T,-35 区,(Pribnow box),T A T A A T Pu A T A T T A Py,-10 区,原核生物启动子保守序列,RNA-pol辨认位点(recognition site),结构基因,-GCGC-CAAT-TATA,真核生物启动子保守序列,转录

4、过程The Process of Transcription,第二节,（一）转录起始,转录起始需解决两个问题：DNA双链解开，使其中的一条链作为转录的模板。RNA聚合酶必须准确地与转录模板的起始区域结合，形成第一个磷酸二酯键。,一、原核生物的转录过程,2.DNA双链解开,1.RNA聚合酶全酶(2)与模板结合,3.在RNA聚合酶作用下发生第一次聚合反应，形成转录起始复合物,RNApol(2)-DNA-pppGpN-OH 3,转录起始复合物:,5-pppG-OH+NTP 5-pppGpN-OH 3+ppi,转录起始过程,（二）转录延长,1.亚基脱落，RNApol聚合酶核心酶变构，与模板结合松弛，沿

5、着DNA模板前移；,2.在核心酶作用下，NTP不断聚合，RNA链不断延长。,(NMP)n+NTP(NMP)n+1+PPi,转录空泡(transcription bubble)：,RNA-pol（核心酶）DNA RNA,目 录,目 录,5,3,DNA,原核生物转录过程中的羽毛状现象,核糖体,RNA,RNA聚合酶,依赖Rho()因子的转录终止非依赖Rho因子的转录终止,（三）转录终止,指RNA聚合酶在DNA模板上停顿下来不再前进，转录产物RNA链从转录复合物上脱落下来。,分类,A T P,1.依赖 Rho因子的转录终止,2.非依赖 Rho因子的转录终止,DNA模板上靠近终止处，有些特殊的碱基序列，

6、转录出RNA后，RNA产物形成特殊的结构来终止转录。,5UUGCAGCCUGACAAAUCAGGCUGAUGGCUGGUGACUUUUUAGUCACCAGCCUUUUU.3,5UUGCAGCCUGACAAAUCAGGCUGAUGGCUGGUGACUUUUUAGUCACCAGCCUUUUU.3,RNA,5TTGCAGCCTGACAAATCAGGCTGATGGCTGGTGACTTTTTAGTCACCAGCCTTTTT.3,DNA,5UUGCAGCCUGACAAAUCAGGCUGAUGGCUGGUGACUUUUUAGUCACCAGCCUUUUU.3,茎环(stem-loop)/发夹(hairpin)

7、结构,茎环结构使转录终止的机理,使RNA聚合酶变构，转录停顿；使转录复合物趋于解离，RNA产物释放。,复制和转录的区别,二、真核生物的转录过程,（一）转录起始,真核生物的转录起始上游区段比原核生物多样化，转录起始时，RNA-pol不直接结合模板，其起始过程比原核生物复杂。,转录起始点,TATA盒,CAAT盒,GC盒,增强子,顺式作用元件(cis-acting element),1.转录起始前的上游区段,AATAAA,切离加尾,转录终止点,修饰点,外显子,翻译起始点,内含子,OCT-1,OCT-1：ATTTGCAT八聚体,2.转录因子,能直接、间接辨认和结合转录上游区段DNA的蛋白质，现已发现数

8、百种，统称为反式作用因子(trans-acting factors)。,反式作用因子中，直接或间接结合RNA聚合酶的，则称为转录因子(transcriptional factors,TF)。,参与RNA-pol转录的TF,3.转录起始前复合物(pre-initiation complex,PIC),真核生物RNA-pol不与DNA分子直接结合，而需依靠众多的转录因子。,TFF,A,B,由RNA-Pol 催化转录的PIC,H,E,TBP,TAF,TFD-A-B-DNA复合物,TATA,A,B,TBP,TAF,TATA,H,E,PIC组装完成，TFH使CTD磷酸化,4.拼板理论(piecing t

9、heory),一个真核生物基因的转录需要3至5个转录因子。转录因子之间互相结合，生成有活性，有专一性的复合物，再与RNA聚合酶搭配而有针对性地结合、转录相应的基因。,（二）转录延长,真核生物转录延长过程与原核生物大致相似，但因有核膜相隔，没有转录与翻译同步的现象。,RNA-pol前移处处都遇上核小体。,转录延长过程中可以观察到核小体移位和解聚现象。,RNA-Pol,RNA-Pol,RNA-Pol,核小体,转录延长中的核小体移位,转录方向,5-AAUAAA-,5-AAUAAA-,核酸酶,-GUGUGUG,RNA-pol,AATAAA GTGTGTG,转录终止的修饰点,5,5,3,3,3加尾,AA

10、AAAAA 3 mRNA,（三）转录终止,和转录后修饰密切相关。,真核生物的转录后修饰Post-transcriptional Modification,第三节,几种主要的修饰方式,1.剪接(splicing),2.剪切(cleavage),3.修饰(modification),4.添加(addition),一、真核生物mRNA的转录后加工,（一）首、尾的修饰,5端形成 帽子结构(m7GpppGp)3端加上多聚腺苷酸尾巴(poly A tail),帽子结构,5 pppGp,帽子结构的生成,（二）mRNA的剪接,1.hnRNA 和 snRNA,核内的初级mRNA称为杂化核RNA(hetero-n

11、uclear RNA,hnRNA)snRNA(small nuclear RNA),真核生物结构基因，由若干个编码区和非编码区互相间隔开但又连续镶嵌而成，去除非编码区再连接后，可翻译出由连续氨基酸组成的完整蛋白质，这些基因称为断裂基因。,断裂基因(splite gene),编码区 A、B、C、D,2.外显子(exon)和内含子(intron),外显子在断裂基因及其初级转录产物上出现，并表达为成熟RNA的核酸序列。内含子隔断基因的线性表达而在剪接过程中被除去的核酸序列。,鸡卵清蛋白基因,hnRNA,首、尾修饰,hnRNA剪接,成熟的mRNA,鸡卵清蛋白基因及其转录、转录后修饰,目 录,鸡卵清蛋白

12、成熟mRNA与DNA杂交电镜图,DNA,mRNA,目 录,3.内含子的分类,根据基因的类型和剪接的方式，通常把内含子分为4类。,I：主要存在于线粒体、叶绿体及某些低等真核生物的 rRNA基因；II：也发现于线粒体、叶绿体，转录产物是mRNA；III：是常见的形成套索结构后剪接，大多数mRNA基因有此类内含子；IV：是tRNA基因及其初级转录产物中的内含子，剪接过程需酶及ATP。,4.mRNA的剪接,除去hnRNA中的内含子，将外显子连接。,snRNP与hnRNA结合成为并接体,目 录,pG-OH(ppG-OH,pppG-OH),剪接过程的二次转酯反应(twice transesterifica

13、tion),RNA编辑作用说明，基因的编码序列经过转录后加工，是可有多用途分化的，因此也称为分化加工(differential RNA processing)。,5.mRNA的编辑(mRNA editing),二、tRNA的转录后加工,tRNA前体,目 录,目 录,碱基修饰,目 录,三、rRNA的转录后加工,四、核 酶,具有酶促活性的RNA称为核酶。,核酶(ribozyme),四膜虫rRNA内含子的二级结构,四膜虫rRNA的剪接采用自我剪接方式,5-端核苷酸序列,最简单的核酶二级结构槌头状结构(hammerhead structure),底物部分,通常为60个核苷酸左右同一分子上包括有催化部份

14、和底物部份 催化部份和底物部份组成锤头结构,除rRNA外，tRNA、mRNA的加工也可采用自我剪接方式。,核酶研究的意义,核酶的发现，发现RNA的新功能；核酶的发现是对传统酶学的挑战；在生物进化中,RNA处于中心位置。,人工设计的核酶,粗线表示合成的核酸分子细线表示天然的核酸分子X 表示一致性序列箭头表示切断点,目 录,附录,四膜虫RNA的自我剪接,逆转录Reverse Transcription,第四节,中心法则（The central dogma）:,基因：为生物活性产物编码的DNA功能片段,1/62,一、概念,逆转录(reverse transcription)指遗传信息从RNA流向DN

15、A，是RNA指导下的DNA合成过程，即以RNA为模板，四种dNTP为原料，合成与RNA互补的DNA单链。,二、逆转录酶(reverse transcriptase),催化逆转录过程的酶称逆转录酶，RNA病毒中都含有此酶。具有三种酶活性：RNA指导的DNA聚合酶 RNA酶 DNA指导的DNA聚合酶,三、合成过程,分子生物学研究可应用逆转录酶，作为获取基因工程目的基因的重要方法之一，此法称为cDNA法。,以mRNA为模板，经逆转录合成的与mRNA碱基序列互补的DNA链。,试管内合成cDNA,cDNA complementary DNA,四、逆转录研究的意义,逆转录酶和逆转录现象，是分子生物学研究中的重大发现。逆转录现象说明：至少在某些生物，RNA同样兼有遗传信息传代与表达功能。对逆转录病毒的研究，拓宽了20世纪初已注意到的病毒致癌理论。,