《基于mRNA技术疫苗生产现场检查手册》.docx

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1、基于mRNA技术疫苗生产现场检查手册2023年910月-X-Z-=_刖三本手册由河北省药品监督管理局发起并组织编写。本手册由北京市药品监督管理局、天津市药品监督管理局、河北省药品监督管理局联合发布实施。一、目的3二、适用范围3三、法规依据3四、mRNA疫苗工艺概述4（一）mRNA疫苗基本工艺简介51、制备环状质粒52、制备线性化质粒53、mRNA疫苗原液生产64、mRNA疫苗制剂生产6（二）mRNA疫苗特点78五、mRNA疫苗生产现场检查要点8（一）机构与人员8（二）厂房设施与设备9（三）物料与产品111、菌毒种管理11122、生产用原辅料管理13（四）确认与验证14（五）文件管理15（六）生

2、产管理161、菌种复苏162、发酵和收获菌泥173、碱裂解及纯化174、质粒线性化185、体外转录（IVT）18196、LNP-mRNA制备19207、层析纯化分离208、超滤219、半成品配制2210、分装、轧盖、灯检2311、储存和运输2412、生产管理检查要点还应包括但不限于25（七）质量控制和质量保证261、实验室管理262、质量控制情况273、数据管理情况284、偏差管理情况295、变更管理情况296、产品质量回顾情况30（八）委托管理情况3031（九）药物警戒管理情况311、机构及人员管理312、质量体系管理313、监测与报告管理31324、风险管理32（十）技术转移32一、目的为

3、指导检查员对基于mRNA技术疫苗（以下简称mRNA疫苗）生产企业开展生产现场检查，保障mRNA疫苗生产过程稳定可控、产品质量安全有效，以风险控制为目的，以药品管理法疫苗管理法及相关法规为依据，制定本检查手册，作为mRNA疫苗生产现场检查基础性技术指导文件，提升mRNA疫苗检查过程中风险识别能力。检查员可参照本手册的要求，对企业的生产和质量管理进行检查。二、适用范围本手册所称mRNA疫苗系指将外源目的基因序列通过转录、合成等工艺制备的mRNA通过特定的递送系统导入机体细胞并表达目的蛋白、刺激机体产生特异性免疫学反应，从而使机体获得免疫保护的一种核酸制剂。本手册适用于北京市、天津市、河北省内mRN

4、A疫苗的GMP检查，包括从生产用菌毒种管理、原辅材料管理、质粒制备、质粒贮存及运输、脂质体包裹、原液生产、制剂生产、产品质量控制、成品入库及留样全过程。三、法规依据1 .中华人民共和国药品管理法2 .中华人民共和国疫苗管理法3 .中华人民共和国生物安全法4 .中华人民共和国药品管理法实施条例5 .疫苗流通和预防接种管理条例6 .病原微生物实验室生物安全管理条例7 .医疗废物管理条例8 .药品生产监督管理办法9 .药品注册管理办法10 .药品生产质量管理规范及其附录11 .生物制品批签发管理办法12 .药品记录与数据管理要求（试行）13 .药品召回管理办法14 .疫苗生产流通管理规定15 .药品

5、上市后变更管理办法16 .疫苗储存和运输管理规范17 .药品说明书和标签管理规定18 .药品注册现场核查管理规定19 .药品不良反应报告和监测管理办法20 .药品生产企业现场检查风险评定原则21 .食品药品监管总局国家卫生计生委关于进一步加强疫苗流通监管促进疫苗供应工作的通知（食药监药化监201776号）22 .国家药监局关于进一步加强疫苗生产企业派驻检查工作的通知（国药监药管202315号）23 .河北省药品上市后变更管理办法实施意见（试行）24 .已上市生物制品药学变更研究技术指导原则（试行）25 .新型冠状病毒预防用mRNA疫苗药学研究技术指导原则（试行）26 .药品共线生产质量风险管理

6、指南四、mRNA疫苗工艺概述mRNA疫苗是将外源目的基因序列通过转录、合成等工艺制备的mRNA通过特定的递送系统导入机体细胞并表达目的蛋白、刺激机体产生特异性免疫学反应，从而使机体获得免疫保护的一种核酸制剂。由于企业产品管线差异，产品工艺步骤可能会有所不同，mRNA疫苗生产一般包括转录模板质粒种子库的建立和检定、原液生产、制剂生产、质量检验等过程。其中，原液生产包括模板生产和mRNA制备，涉及种子复苏、扩增、规模培养、菌泥收集、菌泥裂解、澄清过滤、质粒纯化、质粒线性化、模板纯化、转录反应（可能包含加帽及加尾反应）和mRNA纯化等工序。制剂生产包括mRNA疫苗半成品配制、灌装（可能包含冻干）和包

7、装。（一）mRNA疫苗基本工艺简介以利用大肠杆菌（E.coli）扩增目的基因模板工艺为例，mRNA疫苗生产工艺大致为：1.制备环状质粒：将含目的DNA序列的质粒的菌种复苏后，经摇瓶，种子罐和发酵罐扩增培养，离心收获菌泥。将发酵收获的菌体，经过碱裂解、过滤、凝胶层析去除RNA和宿主残留蛋白等相对较小的杂质、亲和层析去除开环质粒、阴离子交换层析去除内毒素、过滤除菌得到环状质粒中间体。大致步骤举例如下：仲f复昴IT一缎种夕格界ITl二肿广培KlTl发的培诈IT离心IlftIi环状质敕中阿体%I除得过1gtttft-【乐析纯化卜It丽正1图1:环状质粒制备流程图2,制备线性化质粒：将环状质粒中间体经过

8、酶切、离子交换层析、超滤浓缩换液、除菌过滤分装，得线性化质粒中间体，最后分装冻存。大致步骤举例如下：lwmttMHMWIT阴离子层析I-Ii三IT除命过墟I三tftw图2：线性化质粒制备流程图3mRNA疫苗原液生产：以线性化质粒中间体为模板，经IVT反应及纯化工艺后制得mRNA原液。IVT反应体系通常采用含有核昔酸三磷酸底物、聚合酶辅因子、含有多胺和抗氧化剂的PH缓冲液，通过RNA聚合酶催化，以前工序制备的DNA为模板来合成目标mRNAo转录后的mRNA需要经过一系列修饰才能构成完整分子，在5,端形成一个CaP结构，在3，端形成PoIyA尾结构。cap结构和PolyA尾结构可以抑制mRNA被降

9、解，同时增强翻译效率。在体外转录过程中可以将合成好的5,CaP结构添加到特定的转录起始序列，直接转录出具有天然CaPl结构的mRNA。mRNA的加帽工艺有共转录加帽和转录后加帽2种选择。共转录加帽是通过向IVT反应体系中加入7-甲基鸟喋吟二核昔酸、抗反向帽类似物或三核甘酸帽类似物在反应过程中向mRNA的5,端添加Cap结构。转录后加帽是在IVT反应结束后使用牛痘加帽酶反应体系对mRNA进行加帽。以共转录加帽为例-,大敌工艺步骤加EII,I雇祚i匕而粒HI5克应ZH模板去除离广大换了析纯化I原液分装I-I除菌过流IITFF缓柒液置正图3：原液制备流程图mRNA疫苗原液生产流程图4mRNA疫苗制剂

10、生产mRNA疫苗需要穿过细胞膜进入细胞质被翻译成蛋白质而发挥其免疫作用，但mRNA是带负电荷的亲水性大分子，其自主跨膜能力有限且易被体内RNaSe降解。当前有多种方式用于mRNA的递送，如电穿孔法、鱼精蛋白、树状聚合物、阳离子胶束和纳米脂质颗粒（LNP）等，其中LNP是目前最热门的递送技术。LNP的制备方法有挤出法、薄膜水化法、高压均质法、微流控技术等，其中微流控技术应用最为广泛。1.NP在包封时利用微流控技术让含mRNA水相和脂质体有机相按照一定的比例和流速混合，得到LNP-mRNA颗粒。包封后的LNP-mRNA经透析浓缩、过滤等步骤去除细菌、裸mRNA、空载LNP和乙醇等物质，再调节pH,

11、获得mRNA制剂原液。mRNA制剂原液按照无菌注射剂产品分装要求进行灌装，从而得到了用于人体的mRNA疫苗。以LNP-mRNA工艺为例，大致生产步骤如下：入底五金卜灯检注，I；净变：lI:：如都i俵交颗I的区II；吸画图4：mRNA疫苗制剂生产流程图（二）mRNA疫苗特点开发速度快是mRNA疫苗技术最显著的优势。通过研究病原体的基因序列，可以快速地锁定潜在抗原编码片段，将其序列融入DNA模板并以此合成相应的mRNA后，加以脂质纳米包封形成疫苗制剂即可递送至人体。同时，mRNA技术具备一定的通用性，理论上可以利用相似过程开发各类所需要的疫苗。此外，mRNA疫苗还具有以下特点：（1）能导入细胞，在

12、体内表达相应的抗原蛋白，减少了体外蛋白表达、纯化过程；（2）能够刺激免疫系统产生体液免疫和/或细胞免疫应答，发挥相应的免疫预防和/或免疫治疗作用；（3）其递送系统具有类似佐剂的部分特性，能够通过刺激机体免疫系统产生多种细胞因子等方式增强机体免疫反应能力或改变免疫应答类型；（4）由于mRNA的降解是通过细胞正常代谢完成，降低了因感染或整合诱发基因突变的潜在风险。尽管mRNA疫苗具有多重优势，但尚存在诸多风险因素，如mRNA本身具有的潜在免疫原性、递送系统（如脂质纳米颗粒）的稳定性、纳米剂型安全性及所使用阳离子聚合物/脂质体安全性、递送靶向性及递送效力等问题，都会影响疫苗的有效性、安全性和质量可控

13、性，也是我们在生产现场检查中需要重点关注的问题。五、mRNA疫苗生产现场检查要点（一）机构与人员企业应当建立与药品生产相适应的管理机构，并配备足够的、符合要求的人员，为实现质量目标提供必要的基础条件。检查要点包括但不限于：1.机构设置和人员配备、培训情况：所有人员应当明确并理解自己的职责，熟悉与其职责相关的要求，并接受必要的培训，培训与所生产品种工艺及岗位操作是否具有针对性，培训的内容能否与岗位的要求相适应；2 .疫苗生产企业关键人员的资质和实际履行职责情况：生产管理负责人、质量管理负责人和质量受权人是否具有相应的专业知识（微生物学、生物学、免疫学、生物化学、生物制品学等），是否能够在生产、质

14、量管理中履行职责；3 .关键岗位操作人员如无菌操作岗位操作和记录的规范性情况，关键岗位人员转岗程序和培训情况。(二)厂房、设施与设备厂房和设备的设计、布局、维护等需符合既定用途，应当能够最大限度地避免污染、交叉污染、混淆和差错，便于清洁、操作和维护。检查要点包括但不限于：1.原液生产厂房设置能否避免污染与交叉污染：生产环境的空气洁净度级别是否与生产操作相适应，生产过程应采取密闭系统操作，如不可避免时应采取措施防止微生物、病毒、粒子的扩散及污染；其菌种复苏、扩增、培养、纯化过程应符合中华人民共和国生物安全法药品生产质量管理规范(2010年修订)及生物制品附录相关要求；2 .共线生产管理应符合中国

15、药典药品生产质量管理规范及其附录中的相关规定。(1)由于生物制品的复杂性，对于共线生产品种应进行充分的风险评估，评估内容应包括人流和物流、微生物控制、活性物质的理化特性、工艺特点、清洁工艺、环境监测、控制策略、残留成分限度检测能力等；(2)关注防止交叉污染的措施(例如采用阶段式生产、封闭系统、直接接触产品的生产工具按品种专用、一次性使用系统等)；如使用传统的生产系统进行多产品共线生产，应使用经验证的密闭设备、空间消毒、表面消毒、在线清洁和灭菌及气流保护等措施，避免产品的交叉污染；(3)如涉及相同类型产品共线生产，在每一种质粒生产结束后，应当采取有效的方式对生产设备进行灭活和清洁。同时考虑对可能

16、残留有质粒的生产区域进行灭活（如空间熏蒸）和清洁，基于质粒的稳定性，应当采用多种组合的方式进行灭活和清洁，并考虑开发合适的采样及检测方法对质粒的去除效果进行确认；质粒生产中的敞口操作尽可能在生物安全柜、隔离器等设备保护下进行，避免质粒气溶胶的产生，降低不同质粒之间交叉污染的可能性；同时应当基于风险评估对空调系统（如风管、过滤器等）采取处理措施，如增加过滤器等，降低不同质粒之间交叉污染的可能性；3 .关键生产区域及生产设施设备的设计、使用、监控、维护保养情况，特别是除菌过滤系统设计、使用、维护、完整性检测、验证情况等（注意关注：是否在尽可能临近灌装线的位置进行最终除菌过滤、除菌过滤验证是否能有效

17、代表实际除菌过滤工艺、除菌过滤前是否进行微生物限度监测等；关注关键区域如分装间及灌装区域的气流流型是否受到区域内设备布局影响，在线监测设置能否反映操作影响情况等）；4 .关键生产设备确认情况、清洁和维护保养情况、变更情况，包括但不限于超滤（透析）设备、纯化设备、酶切设备、IVT反应器、脂质体制备系统、灭菌设备、灌封设备、包装贴签设备等生产设备；5 .公用系统设置、确认与变更情况，如制药用水系统、洁净区空气净化系统、直接接触产品的工艺用气系统等关键设施；6 .工艺用水、直接接触料液的管路、罐体或耗材表面，以及涉及敞口操作工艺环节的层流保护等方面，是否均能够将潜在RNA酶风险控制在可接受的范围；7

18、 .厂房及设备表面、员工洁净服、重复使用的生产和取样器具、批记录等，关注其清洁验证是否能够有效保证避免RNA酶污染，使用的清洁剂种类是否在风险评估中考虑了RNA酶相关风险等；8 .冷藏设施及冷链运输的确认情况；9 .生产和检验使用的关键衡器、量具、仪表、记录和控制设备的校准情况。(三)物料与产品生产用菌毒种、原辅料应符合相应的质量标准和相关管理规定，防止污染、交叉污染、混淆和差错。检查要点包括但不限于：1.菌毒种管理菌毒种是指直接用于疫苗制造和检定的细菌、病毒、DNA重组工程菌等。菌毒种管理检查要点包括但不限于：(1)生产和检定用菌毒种历史来源清晰、有证明资料；(2)企业菌种库建立情况，应在符

19、合GMP条件下建立主种子批和工作种子批；工作种子批的生物学特性和遗传学特性应与主种子一致；菌种库检定质量标准，是否符合中华人民共和国药典的要求；(3)生产用菌毒种的存储设备需满足存储需要，菌毒种保藏应当备份，且备份种子批应储存于不同的地点或区域(至少是不同建筑物)；(4)菌毒种标签上应至少标明菌毒种编号、名称、代次、批号、制备日期等内容；(5)菌毒种存储区域应当建立人员授权、进出登记制度，避免非授权人员接触菌毒种；(6)菌毒种应在规定的条件下专用设备保存，专人负责；出入库应有规定和记录；(7)菌毒种储存温度，应符合特定菌毒种的特征要求。储存期间，应当对储存条件进行监控，并应当具备报警功能，确保

20、菌毒种储存条件符合要求；(8)应对菌毒种工作种子批进行稳定性考察及判断其代谢稳定性/遗传稳定性的评估方法，及时了解菌毒种储存期间的质量变化，包括对菌种库复苏能力的考察，是否分析菌种储存期间质量变化情况；(9)是否开展种子库遗传稳定性分析(序列大小、序列准确性、质粒限制酶切图谱、质粒拷贝数)并明确各级种子库的限定传代代次及依据；(10)生产、科研及检定用菌毒种应分开存放，不得存放于同一设备。2.生产用原辅料管理mRNA疫苗生产用原辅料管理应符合中国药典三部“生物制品生产用原材料及辅料质量控制规程”的规定，对原辅料进行分级管理。关注用于转录的核甘酸和修饰核甘酸、5,帽类似物、用于mRNA体外合成大

21、量使用的各种酶(如T7转录酶、加帽反应过程中添加的酶等)和缓冲液、原液生产过程中使用的纯化介质(层析柱、磁珠、过滤膜)、溶剂等物料管理情况。原辅料检查要点包括但不限于：(1)供应商评估与审计情况，供应商发生变更或相关质量事件时，应通过有效方式告知采购方；(2)配制培养基、培养液、生产过程中使用的原材料(例如，氨基酸、维生素、牛血清、抗生素、蛋白质、无机盐、碳水化合物等)和各种缓冲液应符合相应质量标准；培养液及生产用缓冲液储存条件与时间应经过验证；(3)生产用一次性耗材的检查检验及放行控制情况；(4)原辅材料、中间产品、原液及成品的接收、检验、留样、储存、放行管理，如生产过程中酶的保存及使用情况

22、、中间产品转移场地使用时运输环节验证情况；(5)物料及产品放行程序设置及执行情况；(6)企业相容性研究情况；(7)成品贮藏和运输等环节是否进行严格管控以确保产品符合贮藏要求；(8)不合格品的处理情况，不予批签发或者撤回批签发的mRMA疫苗销毁管理情况等。(四)确认与验证企业的厂房、设施、设备和检验仪器应当经过确认，应当采用经过验证的生产工艺、操作规程和检验方法进行生产、操作和检验，并保持持续的验证状态。检查要点包括但不限于：1.关键质量属性评估是否充分，关键工艺参数控制情况；2 .关注工艺验证情况，是否对关键工艺参数及重要工艺参数进行验证，如菌种培养、各纯化工序、体外转录、脂质体包封等工序的工

23、艺验证情况，工艺验证能否满足各工序工艺控制要求，具体项目可参考生产管理部分；3 .验证批批量与商业化生产批量是否一致，原液、半成品、成品验证批次对应情况；4 .验证批批间差异情况，工艺是否稳定，能否持续生产出符合既定用途和注册标准的产品；5 .中间产品、原液、成品储存条件、储存期限的验证情况；6 .需特殊管理的原辅材料（如反应过程中使用的酶、帽子结构、POIyA尾、NTPS等物料）反复冻融验证情况（如有）；7 .持续性工艺确认情况，是否对商业化生产的产品质量进行监控和趋势分析，确保工艺和产品质量始终处于受控状态。持续性工艺确认范围和频率规定情况，统计工具使用情况；8 .关键生产设备确认情况，包

24、括但不限于生物反应器、离心、超滤（透析）设备、纯化设备、IVT反应器、脂质体制备系统、灭菌设备、灌封设备、包装贴签等生产设备能否满足工艺控制要求，具体确认项目可参考生产管理部分；9 .关键设备的清洁验证，包括但不限于生物反应器、离心、超滤（透析）设备、纯化设备、IVT反应器、微流控系统的清洁验证情况，清洁程序设定、验证及实际执行情况，能否避免污染与交叉污染；关注其清洁验证中可接受的残留限度以及清洁方法的合理性和适用性；10 .计算机化系统验证与使用情况。（五）文件管理文件是质量保证系统的基本要素，企业需有内容正确的书面质量标准、生产处方和工艺规程、操作规程以及记录等文件。检查要点包括但不限于：

25、1.是否有经企业相关人员审核、批准的现行工艺规程，与注册批准的工艺是否一致，工艺规程的内容是否包括生产处方、生产操作要求及包装操作要求等内容；2,生产用原辅包等物料、中间产品或待包装产品、成品是否有经企业相关人员批准的现行质量标准；与注册批准的质量标准是否一致；3,各生产或检验活动是否有相应的操作规程，操作规程是否具有针对性、能否正确指导生产或检验操作；4 .批生产记录、批检验记录是否依据现行批准的工艺规程和质量标准的相关内容制定，能否详细记录关键操作步骤和关键参数，所查批生产、批检验记录是否符合可溯、清晰、同步、原始、准确等原则；5 .采用信息化手段记录生产、检验数据的情况，是否建立了适宜的

26、数据及记录管理体系，能否与纸质记录(如使用)保持一致，且与相关记录(设备日志等辅助记录)保持一致；是否符合疫苗生产检验电子化记录技术指南(试行)要求。(六)生产管理mRNA疫苗的生产和包装均应当按照批准的工艺规程和操作规程进行操作并有相关记录，以确保mRNA疫苗达到规定的质量标准，并符合药品生产许可和注册批准的要求。由于mRNA疫苗生产工艺的特殊性，各关键工序检查要点包括但不限于：1.菌种复苏将工作代种子接种在适宜的培养基中，经传代扩增至规定代次和规模，获得生产用种子。检查要点包括但不限于：(1)菌毒种操作是否在相应的生物安全级别下进行；(2)菌种遗传稳定性是否经过确认；(3)培养物做纯菌检查

27、，确保种子培养液无污染；(4)生产用种子代次是否为批准的固定代次；(5)生长状态观察及生物学特征确认；(6)应使用经批准的培养基配方；(7)接种环境的清洁、消毒，人员接种操作情况；(8)培养过程参数控制及培养终点控制情况，工艺验证情况。2 .发酵和收获菌泥生产用种子按比例接种至大罐培养基发酵培养，根据细菌的生长特性在发酵过程中适当补充所需的营养物，控制培养温度、搅拌速度、通气量、通气方式、罐压等参数，同时监控溶氧、PH值、生长浓度等。培养过程或培养结束取样进行纯菌检查。检查要点包括但不限于：(1)发酵过程参数控制情况，如接种比例、溶氧、PH值、温度、搅拌速度、培养温度和通气量等参数的监测与记录

28、；(2)关注培养曲线及收获期状态(培养时间、培养浓度)，发酵培养的工艺验证情况；(3)收获培养物纯度、质粒保有率(外源基因拷贝数)检查情况；(4)应使用经批准的培养基配方，培养过程中如需补料，关注补料方式设置及实施情况；(5)发酵培养终点控制情况，离心参数控制情况。3 .碱裂解及纯化菌体在碱性环境下裂解，释放出环状质粒，经酸液中和、过滤、超滤浓缩、纯化等工序得到环状质粒。检查要点包括但不限于：(1)菌泥与缓冲液的混合比例；(2)菌液与碱液的混合比例，裂解过程的PH等参数控制情况；(3)关注裂解菌液与酸液的混合比例，中和液PH等参数控制情况；(4)层析纯化质粒时，常用的是三步纯化法：凝胶过滤层析

29、去除RNA和宿主残留蛋白等相对较小的杂质；亲和层析去除开环质粒；阴离子交换色谱去除内毒素等。层析工序检查要点详见层析部分；(5)纯化后的超螺旋质粒占比检测情况和控制水平，(该比例对于后续的IVT反应有很大的影响。美国FDA关于基因制剂质粒DNA的指导意见指出，超螺旋质粒的占比需要80%)o4 .质粒线性化将环状质粒浓缩、换液，用限制性内切酶进行酶切处理的线性化质粒。检查要点包括但不限于：(1)关注酶切反应条件，如内切酶的用量、温度、反应时间等参数；(2)纯化工序过程控制情况；(3)线性化质粒的储存方式、储存条件和储存时限是否经过验证，如存在中间产品转移生产场地使用，应关注运输环节验证情况；(4

30、)线性化效率、模板浓度、DNA模板序列准确性、纯度、杂质残留控制及检测情况等。5 .体外转录(IVT)以线性化质粒为模板，在反应器或一次性反应袋中经体外转录得mRNA,再经纯化去除酶、NTPs以及不含POIy（八）的mRNA、双链RNA,不完整的转录产物和聚体等杂质后可得mRNA原液。该工序检查要点包括但不限于：(1)关注转录过程原料质量控制情况；(2)反应器或一次性反应袋使用情况；(3)体外转录工艺中的反应体系，起始物料的配比情况及均匀度、RNA聚合酶浓度、NTP浓度、转录时间、温度、终止反应条件等参数控制情况；(4)模板去除过程控制情况，如DNA酶处理工艺中的DNA酶浓度、处理时间、温度、

31、终止反应条件等参数控制情况；(5)关注加帽步骤中RNA反应浓度、温度、时间，加帽反应缓冲体系、物料投料比(如5,-帽类似物、鸟甘三磷酸、核糖核酸酶抑制剂、相关转移酶等)、补料方式、反应温度、时间等参数控制情况；(6)纯化工序过程控制情况；(7)质量控制情况，如mRNA鉴别、mRNA序列长度、序列完整性及准确性、mRNA理化特性(如pH、外观等)、mRNA含量、加帽率、纯度、产品相关杂质(如不完整mRNA、双链RNA等)、工艺相关杂质(如残留蛋白酶、DNA模板残留、有机溶剂、金属离子残留等)、无菌、内毒素等。6 .LNP-mRNA制备在包封时利用微流控技术让含mRNA水相和脂质体有机相按照一定的

32、比例和流速混合，可以得到粒径稳定、均一性较好的LNP-mRNA颗粒，包封后的LNP-mRNA需经透析浓缩、过滤等步骤去除细菌、裸mRNA、空载LNP和乙醇等物质。该工序检查要点包括但不限于：(1)是否使用有机溶剂，有机溶剂引入及去除情况；(2)水相、油相配制参数、储存条件及储存时限验证情况；(3)混合孔径、脂相流速、水相流速等关键参数控制情况；(4)使用多台微流控设备时，不同微流控设备之间中间产品的均一性；(5)关注包封后的LNP-mRNA粒径、空载LNP量、包封率、包封均一性等指标控制及验证情况。7 .层析纯化分离目前在mRNA疫苗生产中应用较多的层析分离技术为离子交换层析、亲和层析和凝胶过

33、滤层析等。离子交换层析影响分离的因素主要有缓冲液的pH、盐浓度等参数；亲和层析影响因素主要有缓冲液的组成、用量等参数；凝胶过滤影响因素主要有进样体积、柱效、柱高等参数。对层析工艺的检查要点包括但不限于：(1)关注层析工艺与批件的一致性，如层析介质(填料)类型、柱床体积、柱床高度、制品上样体积、缓冲溶液组成及用量、层析压力、层析流速、pH、电导等，并定期监测柱效；(2)层析介质(填料)的再生、使用寿命(重复使用次数)是否有规定并进行相关验证;(3)层析系统和层析介质(填料)的清洗和保存能否防止污染，是否经过验证；层析填料的保存条件和保存有效期是否有规定；(4)层析系统是否经过确认；(5)关注层析

34、目标产物收率，层析工艺对杂质去除能力及效果确认；(6)各层析循环(如涉及)之间产品质量均一性；(7)各层析工序收集液保存条件和时间、存放效期验证情况；(8)纯化工艺过程中杂质控制情况，疫苗杂质包括产品相关杂质(如不完整mRNA、双链RNA,裸mRNA、空载LNP等)和工艺相关杂质(如蛋白质残留、有机溶剂残留、DNA模板残留、金属离子残留等)。8 .超滤mRNA疫苗生产过程中超滤工艺包括透析和浓缩，超滤工艺的主要控制参数包括超滤膜的截留分子量(MolecularWeightCut-off,MWCO)超滤膜面积、透膜压力(TranSmembranepressure,TMP)和超滤温度等。检查要点应

35、包括但不限于：(1)超滤工艺应与批件一致性，关注超滤膜包的截留分子量，超滤过程中进/出/滤过液压力(透膜压力)、制品温度、缓冲液倍数(用量)；(2)超滤系统是否经过确认；(3)关注膜包的型号、面积、孔径、数量、生产商材质，以及相应的供应商管理情况；(4)超滤透析过程中是否有相应监测泄漏的措施；(5)是否有膜包使用次数、更换周期、贮存条件及方式等规定并有相关验证，膜包的相容性和完整性测试规定及执行情况；(6)超滤膜包的维护、清洁、保存应能防止污染；(7)超滤是否有最长允许工艺时限规定。9 .半成品配制原液经一次配制或多次配制成为半成品。配制时，应根据批准的产品注册标准的配方进行计算。检查要点包括

36、但不限于：(1)半成品的配制、分装、冻干、轧盖工艺是否经过验证，是否经过无菌工艺模拟试验证明其无菌保证水平符合要求；(2)是否按照经批准的配方进行半成品配制；(3)使用的计量设备是否经过校验，配方的计算、物料的称量及添加是否经复核确认；(4)配制工艺应能确保配制后半成品的均一性，如物料加入后的搅拌时长及搅拌转速应进行规定；(5)如果需要调整PH值，应对PH调整液的浓度及添加速度进行规定；(6)半成品检测用样品应具有代表性，且取样操作不得引入污染;(7)半成品需要存放的，应保存在合适的容器中并按经过验证的条件(如温度、时间)下储存；(8)半成品配制完成后至除菌过滤之前的时间时隔是否有规定；关注除

37、菌过滤压力；除菌滤芯相容性验证情况及完整性检测情况；(9)若使用一次性配制系统/一次性容器进行配制，应对制品安全性进行充分评价(包括相容性试验等)；一次性配制系统/一次性容器使用前包装方式应能控制污染风险，配制系统的搅拌方式应能满足工艺要求；(10)半成品配制工艺应经验证，确定关键控制参数，包括加料程序、混匀方式、制品PH范围、配制时限及温度等；应在经验证的工艺时限内完成配制；(11)原液及半成品的包装方式、存放温度及时间是否经过验证；原液及半成品微生物控制情况；(12)原液、半成品、成品批次划分与对应情况。10 .分装、轧盖及灯检包装mRNA疫苗的分装、轧盖、灯检、包装、贮藏、运输等操作，应

38、按照中国药典三部通则生物制品分包装及贮运管理的规定进行。检查要点包括但不限于：(1)关注批号及亚批号的划分及编制规则；(2)分装容器及用具的清洁、灭菌工艺应经过验证；(3)待分装半成品配制完成至分装放置时限是否经过验证；(4)分装过程中的产品的均一性控制情况；(5) mRNA疫苗是对温度较为敏感的疫苗制品，应关注分装过程中的对产品温度的控制措施；(6)分装开始至结束时间应有时限规定，培养基模拟灌装试验时间是否能够覆盖最长时限；(7)应对密封后溶液进行容器密闭性检查；(8)生产过程抽样应具有代表性，应在分装过程中前、中、后阶段分别抽样；(9)制品贮存温度与生产环境温度不一致时，应通过质量研究确定

39、各工序生产时限；(10)如使用全自动灯检机，应对比评估全自动灯检与人工灯检的检测效能，使用前进行校准和检查。11 .储存和运输疫苗的储存和运输应符合疫苗流通和预防接种管理条例及其相关规定。(1)关注企业是否制定对应的生产、搬运、暂存、仓储及物流管理制度；(2)贮存区的设计和建造应能满足产品贮存条件(如温湿度、避光)和安全贮存的要求，产品贮存条件应符合药品注册批准的要求，贮存环境是否可持续监测，是否配备报警设备，报警方式设置及控制情况；(3)冷链储存和运输设备设施是否有效管理并符合预定用途，冷链运输是否经过验证，超温条件下的暴露时限以及冷链运输过程中是否有全程的温度控制和记录；(4)应对冷库、储

40、运温、湿度监测系统以及冷藏运输的设施设备进行确认及定期的再确认，冷库、冷藏车及冷藏箱应根据国家要求及GSP标准进行验证，包括热分布，断电、开门、外界环境等恶劣条件挑战试验；(5)生产和运输过程中如存在脱冷链情况，应依据脱冷链时间和温度对制品质量影响进行相关研究，确定可允许的脱冷链时间和可接受的温度限度；(6)疫苗是否实施效期预警管理，疫苗应按照规定的发货顺序进行发货，无法在有效期内配送至接种单位的疫苗不得进入流通环节；(7)如采用配送企业运送产品，应当符合上述有关规定，至少包括资质审核、配送能力评估、签订储存配送合同和质量协议、配送企业资料备案等；(8)发运记录应完整，至少包括产品名称、规格、

41、批号、数量、收货单位和地址、联系方式、发货日期、运输方式等；(9)追溯体系应完整，应保证疫苗最小包装单位生产和销售环节的可追溯性。12 .生产管理检查要点还应包括但不限于：(1)各生产、包装工序操作与工艺要求是否一致，设备运行参数是否在规定范围内；(2)能否采取有效措施防止混淆、差错、污染与交叉污染,如是否采取有效措施防止RNA酶污染；（3）共线生产管理情况，企业共线生产管理是否符合中国药典药品生产质量管理规范（2010版修订）及其附录、其余相关法规中的规定，共线风险评估是否充分；（4）无菌保障情况：关注摇瓶培养、种子培养、发酵培养、环状质粒、线性化质粒、原液生产阶段中微生物及RNA酶控制、成

42、品生产阶段的无菌保证情况；关注取样、加料、中间品转运时，各类连接的无菌保障程度；人员更衣确认、无菌工艺模拟试验情况、共线风险评估、清洁消毒验证、关键洁净生产区潜在污染风险（如灌封间等关键A级及B级区域是否存在难以有效清洁消毒的死角，灌装缓冲罐及过滤系统设计与安装情况是否存在对关键B级区的不利影响，对灌装期间A级区可能开门干预位置外部B级区域进行延展层流设计必要性的质量风险管理等）、防止污染和交叉污染的措施；关键区域的气流烟雾试验、洁净环境监测情况等。（七）质量控制和质量保证企业应当建立符合疫苗质量管理要求的质量目标，将疫苗注册的有关安全、有效和质量可控的所有要求，系统地贯彻到疫苗生产、控制及产

43、品放行、贮存、发运的全过程中，确保所生产的疫苗符合预定用途和注册要求。13 .实验室管理mRNA疫苗质量检验包括原辅料检验、中间产品检验和成品检验，特别关注DNA转录模板、mRNA原液、制剂中间产物和制剂成品的鉴别、理化、含量、纯度和安全性项目。除对实验室常规检查外，检查要点包括但不限于：(1)质量控制实验室的人员、设施、设备是否与mRNA疫苗产品性质和生产规模相适应；检验仪器设备按生产要求配置和使用的情况；检验仪器设备的操作规程、使用日志等文件的管理情况；仪器设备的校准、变更、确认与验证的管理情况等；(2)实验室人员是否经过与所从事的检测操作相关的技能培训，并定期进行培训效果评估；(3)分析

44、方法的转移及确认情况，新建立或改良的方法是否进行方法学验证；(4)标准品或对照品的管理情况，标准品/参考品应能够溯源。如自制工作标准品/参考品，是否建立质量标准，是否按照规定用法定标准品/参考品进行标化并确定有效期；(5)动物房的设计、建造及动物饲养管理要求等，应当符合实验动物管理的相关规定；(6)生产和检定用动物应当符合中华人民共和国药典的要求，应使用符合相关要求或级别的实验动物，除另有规定外，均应使用清洁级或清洁级以上的动物，实验动物应来源清晰；(7)动物实验人员应为专职人员，并应当经过培训，考取相关资格证书。14 质量控制情况(1)中间产品、原液、成品稳定性考察情况：是否有稳定性考察方案

45、或计划，包括研究对象、批次、样品数量、环境(如温度、湿度、光照、震动等)、时间、考察项目、检测方法、质量标准等；中间产品(涉及储存的)、原液、半成品(涉及储存的)、成品等是否进行稳定性考察；稳定性考察的样品应具有代表性，如工艺验证、偏差涉及的批次、新申报的疫苗及变更引起的稳定性考察一般至少三批；上市产品每种规格、每种包装形式应每年至少考察一批；(2)生产过程中各工序关键项目检测结果及趋势分析；(3)物料检验情况，如原辅料检验(如脂质体原料、碱基等)、中间产品检验和成品检验，关注DNA模板、mRNA原液、制剂中间产物和制剂成品的鉴别、理化、含量、纯度和安全性，以及LNP-mRNA体系粒径均一性、

46、包封率等项目；(4)关注如含量(RNA,脂质)，纯度，生物活性，序列鉴别，包封率，加帽率，产品和工艺相关杂质，反应溶剂残留等控制项目及质控方法的方法验证；(5)实验室超标与超常结果处理情况；(6)是否存在委托检验及委托检验项目的管理与执行情况。15 数据管理情况(1)关注企业采用信息化手段记录生产、检验数据的情况，生产检验信息和采集系统验证、使用情况；(2)关键批次生产、检验(原辅料、中间产品、成品及相关稳定性考察)相关数据(包括记录)、工艺验证、清洁验证、设备确认及日常监测数据是否符合可溯、清晰、同步、原始、准确等原则的情况，数据保存应当确保能够完整地重现数据产生的步骤和顺序生产、检验或其他

47、相关记录中的签名能够追溯至数据的创建者、修改人员及其他操作人员；(3)是否建立了适宜的数据及记录管理体系；生产和检验所用计算机化系统应当经过验证，相关用户分级管理权限是否设置合理，相关制度文件能否有效措施防止数据的修改、删除、覆盖等，以确保数据可靠；(4)电子数据管理的情况(可产生电子数据的生产设备、检验设备的权限和数据管理，烟雾试验、培养基模拟灌装试验等关键视频数据管理)等。16 偏差管理情况(1)偏差处理操作规程、记录等管理文件的制定情况；偏差的发现、报告、调查、评估和处理的执行情况；纠正预防措施的执行、记录及有效性评估的情况等；(2)是否根据偏差性质、范围、对产品质量潜在影响程度制定偏差分类标准，分类的准确性；涉及重大偏差生产批次的调查、评估、处置情况；可能影响产品质量的重大偏差调查、审核、处理、评估过程