实验七细菌生长曲线.doc

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1、-细菌生长曲线测定一、 实验目的1. 了解细菌生长曲线特征，测定细菌繁殖的代时2. 学习液体培养基的配制以及接种法3. 反复练习无菌操作技术4. 了解不同细菌，不同接种法在同一培养基上生长速度的不同5. 掌握利用细菌悬液混浊度间接测定细菌生长的法二、 实验原理将一定量的菌种接种在液体培养基，在一定的条件下培养，可观察到细菌的生长繁殖有一定规律性，如以细菌活菌数的对数做纵坐标，以培养时间做横坐标，可绘成一条曲线，称为生长曲线。单细胞微生物发酵具有4个阶段，即调整期迟滞期、对数期生长旺盛期、平衡期稳定期、死亡期衰亡期。生长曲线可表示细菌从开场生长到死亡的的全过程动态。不同微生物有不同的生长曲线，同

2、一种微生物在不同的培养条件下，其生长曲线也不一样。因此，测定微生物的生长曲线对于了解和掌握微生物的生长规律是很有帮助的。测定微生物生长曲线的法很多，有血细胞计数法，平板菌落计数法，称重法和比浊法。本实验才用比浊法，由于细胞悬液的浓度与混浊度成正比，因此，可以利用分光光度计测定菌悬液的光密度来推知菌液的菌液的浓度。将所测得的光密度值OD600与对应的培养时间做图，即可绘出该菌在一定条件下的生长曲线。注意，由于光密度表示的是培养液中的总菌数，包括活菌和死菌，因此所测生长曲线的衰亡期不明显。三、 实验仪器、材料和用具大肠杆菌，枯草杆菌，金黄色葡萄球菌菌液及平板；培养基(100mL/250mL三角瓶*

3、10瓶/大组)，牛肉膏蛋白胨葡萄糖培养基；取液器(5000ul, 1000ul 各一支)；培养箱，摇床，722s分光光度计；比色皿3个+共用参比杯一个。四、 实验步骤1. 准备菌种已做：将细菌接种到牛肉膏蛋白胨葡萄糖三角瓶培养基中，37振荡培养18h，另外准备单菌落平板各1块；2. 接种，分成3小组做，实验结果共享：第1小组1) 取1.0ml大肠杆菌菌液接种到100ml培养基，37 200rpm2) 取2.0ml大肠杆菌菌液接种到100ml培养基，37 200rpm3) 取4.0ml大肠杆菌菌液接种到100ml培养基，37 200rpm第2小组4) 取1.0ml金黄色葡萄球菌接种到100ml培

4、养基，37 200rpm5) 取1.0ml金黄色葡萄球菌接种到100ml培养基，37 110rpm6) 取1.0ml金黄色葡萄球菌接种到100ml培养基，30 200rpm第3小组7) 取一个大肠杆菌菌落接种到100ml培养基，37 200rpm8) 取1.0ml大肠杆菌菌液接种到100ml培养基，37 110rpm9) 取1.0ml大肠杆菌菌液接种到100ml培养基，30 200rpm每培养一小时取样一次(2.5h,3.5h加测1次)。对照组测量起始pH，所有瓶子测量发酵9h完毕测pH。注意全班同时取样，同时开场振荡，取样期间时间不算。发酵时间7小时。3. 测量：取500ul培养液到2000

5、ul自来水中，以自来水为对照，测OD600；注意固定参比杯和每个比色皿；固定取样器；固定波长；固定一台分光光度计；零小时也要测，把结果填入下表。表1. 生长曲线OD600值时间/h组号0122.533.54567初始pH最终pH123456789五、 实验结果与讨论1. 数据1) 第一组a) 1.0ml大肠杆菌,37 200rpmb) 2.0ml大肠杆菌,37 200rpmc) 4.0ml大肠杆菌,37 200rpm一个大肠杆菌菌落，37 200rpm1.0ml大肠杆菌，37 110rpm1.0ml大肠杆菌，30 200rpm表2. 第一组生长曲线OD600值开场取样时间2:203:304:3

6、55:106:006:357:108:159:2010:25完毕取样时间2:303:354:405:15-5:306:056:407:158:209:25发酵时间/h0122.533.545670Dt a b c0.0090.0300.0690.0.0490.0900.0.1130.1920.1600.2160.2590.2490.3180.4400.3190.4080.5320.4100.4160.5410.6940.6961.1020.5160.5310.5500.4520.5580.562OD=ODt-OD0 a bc0000.0150.0190.0.0760.0.1230.1510.0

7、.1900.2400.2880.3710.3100.3780.4630.4010.3860.4720.6850.6661.0330.5070.5010.4810.4430.5280.493注：由于5:15-5:30没有开摇床，故往后顺延15min，下同。2) 第二组d) 1.0ml金黄色葡萄球菌，37 200rpme) 1.0ml金黄色葡萄球菌，37 110rpmf) 1.0ml金黄色葡萄球菌，30 200rpm表3. 第二组生长曲线OD600值开场取样时间2:203:304:355:106:006:357:108:159:2010:25完毕取样时间2:303:354:405:15-5:306

8、:056:407:158:209:25发酵时间/h0122.533.545670Dt d e f0.0340.0.0.0.0.0.1310.0880.0.0.1210.2190.2810.0.3100.3740.2780.4370.4490.3400.4030.5180.4800.4300.5400.5340.4040.5820.6160.472OD=ODt-OD0 d ef0000.0170.0040.0170.0.0.1060.1440.0860.1900.2470.1460.2810.3400.2430.4080.4150.3050.3740.4840.4450.4010.5060.49

9、90.3750.5480.5810.4433) 第三组g) 一个大肠杆菌菌落，37 200rpmh) 1.0ml大肠杆菌，37 110rpmi) 1.0ml大肠杆菌，30 200rpm表4. 第三组生长曲线OD600值开场取样时间2:203:304:355:106:006:357:108:159:2010:25完毕取样时间2:303:354:405:15-5:306:056:407:158:209:25发酵时间/h0122.533.545670Dt g h i0.0340.0300.0330.0.0520.0400.0780.1750.1120.1400.2710.2000.2250.4310

10、.2100.3170.4410.2930.4310.4770.4680.4450.4220.5100.4870.4670.5540.4970.4070.577OD=ODt-OD0g hi000-0.0050.0.0070.0440.1450.0.1060.2410.0.1910.4010.1770.2830.3810.2600.3970.4470.4350.4110.3920.4770.4520.4370.5210.4630.3770.5444) pH表5. 发酵液pH测定实验组对照组第一组abc6.7pH4.64.44.2第二组defpH4.64.64.4第三组ghipH4.44.54.42

11、. OD曲线的绘制1) 第一组a) 1.0ml大肠杆菌菌液,37 200rpmb) 2.0ml大肠杆菌菌液,37 200rpmc) 4.0ml大肠杆菌菌液,37 200rpm图1 第一组生长曲线2) 第二组d) 1.0ml金黄色葡萄球菌，37 200rpme) 1.0ml金黄色葡萄球菌，37 110rpmf) 1.0ml金黄色葡萄球菌，30 200rpm图2 第二组生长曲线3) 第三组g) 一个大肠杆菌菌落，37 200rpmh) 1.0ml大肠杆菌，37 110rpmi) 1.0ml大肠杆菌，30 200rpm图3 第三组生长曲线3. 代时计算根据表2中的数据，做lgOD-t函数。1) 第一

12、组表6 第一组Lg(OD600)Lg(OD600)abc1h-1.823909-1.72125-1.677782h-1.119186-1.08092-0.910092.5h-0.821023-0.73049-0.721253h-0.619789-0.54061-0.430633.5h-0.508638-0.42251-0.334424h-0.396856-0.41341-0.326065h-0.164309-0.176530.01416h-0.294992-0.30016-0.317857h-0.353596-0.27737-0.30715图4 第一组lg(OD600)-t 曲线2) 第二组图

13、5 第二组lg(OD600)-t 曲线3) 第三组图6 第三组lg(OD600)-t 曲线图4,5,6中取直线局部，用公式： Gt1-t2/(lgW1-lgW2)/lg2来计算各瓶的代时。计算结果见表7。表7. 各发酵条件下的代时组号t1/ht2/hlgOD600lgOD600代时G/mina12.5-1.823909-0.82102327.01474b12.5-1.72125-0.7304927.34537c12.5-1.67778-0.7212528.32394d24-1.01323-0.3819557.22278e23.5-1.27572-0.6143940.96699f23.5-0.9

14、7469-0.3893446.28462g23.5-1.35655-0.5482133.51647h13-1.65758-0.3968628.65315i14-2.1549-0.3615130.21393准确到分钟即可由上表可以看出大肠杆菌代时短于金黄葡萄球菌，但是也有一些数据不太合理，比方说d组，其数值与同一组相比差距很大，且不符合预期，这可能是由以下原因造成的：i. 人为误差。我们是分组实验，无论是取样稀释，还是测量OD600时，都存在个人操作上的差异，所以实验数据有一些随机波动。尤其是在取样的过程中，吸取菌液的位置不同，会对结果产生较大影响。ii. 实验法误差。我们是采取隔一个小时或者半

15、个小时测量一个点的OD值，没有实时监控，所以做出来的曲线会有差异。另外，由于我们每隔一段时间就停顿摇床，开场取样，这样干扰了细菌的生长，导致了生长期的改变。并且，使用OD值来代表菌体的量的改变误差比较大，死亡的菌体，培养基的变化等都会影响到样品的OD值，我们没有方法得到真实的细菌浓度。另外本次实验有个重大的问题，就是有15分钟摇床没有开启，大约在2.5h的时候，而此时正是细菌生长最旺盛处于对数期的时候。4. 不同因素对于生长曲线的影响1) 接种量图7 第一组生长曲线由图7可以看出，虽然三组几乎同时到达顶峰，但是c最先进入对数期，a最晚进入，说明接种量在一定围增大，能缩短延迟期。2) 菌液接种和

16、固体平板接种图8 菌液与菌落接种大肠杆菌生长曲线由图8可以看出，菌落接种要比另外三组更晚进入对数期，将其数据与同样条件下的菌液接种第一组实验结果进展比照，发现菌落接种确实造成较长的延迟期。这可能是因为大肠杆菌从固体培养基环境移动到溶液环境需要较长时间适应，而液体的接种只需要适应不同的培养基成分和浓度即可。3) 摇床转速图9 第二组生长曲线由图9可以看出，d(1ml金黄色葡萄球菌，37 ,200rpm)与e(1ml金黄色葡萄球菌，37 ,110rpm)相比仅转速不同，d较早进入对数期。说明在一定围，提高转速，有利于细菌生长。这是因为增加转速能提高溶氧量。但是转速也有一定限度，转速过高，会使细胞破

17、裂。不过摇床不是离心机，应该问题不大。4) 温度由图9可以看出，d(1ml金黄色葡萄球菌，37 ,200rpm)与f(1ml金黄色葡萄球菌，30 ,200rpm)相比，d温度较高，但似乎要慢于f，但是差异不大。可能是实验中有其它因素干扰。但理论上讲，温度影响细菌细胞酶的活性，会影响细菌的新代，一定围升高温度有助于尽快进入对数期。不过也可能是因为30 比37 更接近于金黄色葡萄球菌的最适生长温度。六、 思考题1. 为什么可用比浊法来表示细菌的相对生长状况.细胞悬液的浓度与混浊度成正比lambert-beer公式因此，可以利用分光光度计测定菌悬液的光密度来推知菌液的菌液的浓度，从而在一定程度上反响

18、细菌的相对生长状况。但是需要注意的是吸光度所指示的为培养瓶的菌体总含量，而非瓶的活菌量，所以在生长曲线中并没有明显的死亡期。2. 生长曲线中为什么会有平衡期和死亡期.平衡期：由于本次实验所使用的培养环境为封闭式的培养环境，中间没有加料，所以随着营养物质的消耗，代产物的积累和pH等环境因素的变化，培养基环境不再适于细菌的生长繁殖，从而导致细菌的净生长速率逐渐接近于零，单位时间细菌二分裂增加的细胞数量接近于细菌死亡的细胞数量，从而使生长进入平衡期总菌量根本不变。这时，死亡细胞数和繁殖细胞数处于平衡状态，细胞总数将处于稳定状态。死亡期：平衡期后如果继续培养，细胞总数不再稳定，由于培养基中营养物质和氧

19、气的消耗不利于细菌繁殖，并且细菌开场合成次级代产物，影响培养基的PH或者造成培养基的毒性等，对细菌的生存有害，死亡细胞数将逐渐增加，死亡速度超过繁殖速度，使进入死亡期。3. 什么条件下接种为宜.液体种子比固体种子有什么优越性.通过本次实验，我们可以看到，接种量、接种式和培养条件溶氧量和温度等对细菌调整期的长短，细菌的代时即生长速度均有非常关键的影响。只有在采取最正确接种式和接种量，在该菌种最适条件下进展培养，才能使得细菌迅速渡过调整期，并快速进展生长繁殖。最适宜的接种菌种应该是处在生长曲线的对数区的菌液。此时细菌已经度过调整期，生长繁殖最为旺盛，生命力最强大，各种分解和合成代反响都被充分激活，

20、对环境有最强的适应能力。从实验结果可知，在细菌的最适温度、溶氧条件下，接种适当数量的对数期液态种子最好。液体种子相比于固体种子，调整期短很多，可以快速进入对数期，工业生产期短，设备利用效率高。原因如下：液体种子所含细菌易于扩散和分布到培养基中，如采用固体种子，可能会使接种环上附着的菌体不能完全进入液体培养基中，而且固体种子在培养基中不宜均匀分散。用液体种子向液体培养基中接种，特别是如果接种前后培养基的成分和培养条件一致，则细菌前后的生活环境根本一样，调整期很短，而固体种子接种则由于环境变化比较大，调整期较长。4. 根据实验结果，谈谈在工业上如缩短发酵时间.接种处于对数期的液体种子，接种前充分活

21、化，接种量应尽可能多；把培养条件调整到最适合发酵用菌的条件，如温度、溶氧、pH；连续发酵，不断补充培养基，别离代产物。另外，工业生产一定要注意无菌操作。工业设备体积庞大，灭菌非常麻烦而且本钱高、影响生产，使用抗生素的话本钱过高，不利于市场。七、 实验总结这次实验由于要观测细菌生长期，所以持续时间很长，一直到晚上十点半。这让我回想起了暑期实验的那段发酵罐时光，也是一整天都泡在实验室里。虽然这次省略了一些数据的测量，但由于没有收集装置，还是要无菌操作的，更要求全班步调一致，对操作速度有要求，必须在5min送回培养瓶。这次实验还是出现一些问题，比方说五点多的一次有15分钟没有开摇床，后来听说好似是我们组管这个，在此抱歉反思一下，真是太不慎重太大意疏忽了。由此感触，团队中的每一个人都不能掉链子，一定要做好自己的本职工作。八、 参考文献1. 金春，国强. 微生物学实验指导. ：清华大学，20052. 教师PPT. z.