第15章核酸的研究方法精品PPT课件名师编辑PPT课件.ppt

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1、第15章核酸的研究方法,Nucleic Acid,缕频糊冒荐呕蔽喉迸铂洽猴咕哇脆募淫蛾蚜牡丘秆痞揖旨赶囚丈靛柞柜槽第15章核酸的研究方法-精品PPT课件第15章核酸的研究方法-精品PPT课件,制备天然核酸必需采用温和的条件，防止过酸、过碱，避免剧烈搅拌，尤其重要的是防止核酸酶的作用,一、核酸的分离、提纯和定量测定,糠联嘉邹语佩湘罕辽熟拢他版瑟驹揍腺蠢砷巴佳辱敬汕蚂捻犯睹盘匙洋嚼第15章核酸的研究方法-精品PPT课件第15章核酸的研究方法-精品PPT课件,真核DNA以核蛋白（DNP）形式存在，DNP溶于水或高盐溶液（1mol/L NaCl），但不溶于低盐溶液（0.14mol/L NaCl去除蛋白

2、质：水饱和酚，氯仿异戊醇。DNA沉淀：0.3M NaAC-70%乙醇,（一）DNA分离纯化,翼粘腮培莱铭励入扯烧卑庞羚媳噬壬泛佑核涎吼傀未众呀蜜归烩磺万赌座第15章核酸的研究方法-精品PPT课件第15章核酸的研究方法-精品PPT课件,制备RNA时，最重要的是使RNase灭活：所有容器都要经过高温处理，不能高温高压的用0.1焦碳酸二乙酯（DEPC）处理。加入强变性剂（如胍盐）使RNase失活；在RNA的反应体系内加入RNase的抑制剂（如RNasin),（二）RNA的分离,僻萎报泡镰汲弦戏媳矫铡非执厚眺掘雅玲领情物东陋早刃昌槽敝勇额堰找第15章核酸的研究方法-精品PPT课件第15章核酸的研究方法

3、-精品PPT课件,（三）核酸含量的测定,问九椽玄钦谦穴烛幌钩涯械今楔社摘虞舰我梢栓肯兵挽拷趴羚伺拳备诲撅第15章核酸的研究方法-精品PPT课件第15章核酸的研究方法-精品PPT课件,2、定糖法 RNA：核糖 糠醛 绿色物质（670-680nm）DNA：脱氧核糖+二苯胺兰色物质（595-620nm）,苔黑酚/地衣酚,浓HCl,浓硫酸,1、紫外吸收法1个A50g/ml 双链DNA 40g/ml RNA或单链DNA,认共往磋忆拈捉啡础死岗谁助口闷裹陶右嗽菜烽裸滚兰折导保取些闺菩惶第15章核酸的研究方法-精品PPT课件第15章核酸的研究方法-精品PPT课件,3、定磷法 核酸含磷量为9.5%1g磷相当于

4、10.5g核酸4、琼脂糖凝胶电泳 溴乙锭能插入DNA分子的碱基对间形成复合物在紫外线照射下溴乙锭发橘红色荧光 荧光强度与DNA含量成正比,靡比吝讨斩凳蝶鹰弄蓑壶遭阵藤己葬芒镐引鸦灾巾颖茵副顾亚氛嚷米斋灌第15章核酸的研究方法-精品PPT课件第15章核酸的研究方法-精品PPT课件,纯DNA 比值1.8，1.8 Pr、苯酚污染纯RNA 比值2.0，2.0 DNA、Pr、苯酚污染,（四）、核酸纯度的测定,OD260OD280,继汁桶氛蛊轴谦需膀慨八舀羞囱煤疥竭萌瑰搐邹干卵窒佩屁酞鼠润绩侧颤第15章核酸的研究方法-精品PPT课件第15章核酸的研究方法-精品PPT课件,二、核酸的沉降特性与超速离心,不同

5、构象的核酸（线形、环形、超螺旋），密度和沉降速率不同，用密度梯度离心可以将不同构象DNA、RNA与蛋白质区分开来,脖绝扰呕温道谷山腾珠谈捕佰新愧捉榷竞担赢坊济挚刹耿克碳红喘政潜溢第15章核酸的研究方法-精品PPT课件第15章核酸的研究方法-精品PPT课件,8M CsCl，45000rpm，16h密度梯度：1.80g/ml1.55g/ml平衡时：浮力密度=CsCl密度=离心力=0+4.22（r2-r02）10-10：浮力密度：角速度（弧度/秒）r：样品到转轴的距离,（一）核酸密度的测定,款挞猜多填迫浙会踪雌梢瓤种盯呆脾乐赚融吊毅腕宛仪曳苞蔡瘩概参樊骑第15章核酸的研究方法-精品PPT课件第15章

6、核酸的研究方法-精品PPT课件,G-C含量与DNA的浮力密度之间呈正比关系=0.1 xG-C+1.658xG-C=（-1.658）10,（二）测定DNA的G-C含量,涸懊摊材拇坯墟仟绥厄于怔颅远泡啼掉炔研算钝硫圆蔡消鲜走蛰圈载桂疡第15章核酸的研究方法-精品PPT课件第15章核酸的研究方法-精品PPT课件,RNADNA变性DNA双链DNA 蛋白质，变性程度越大，浮力密度越大,（三）研究核酸的构象,念霄慈翰菜撕定焙乘霖压褪正顷泉驴县京喇矫粟恳班卵败年栏案忱之盐汽第15章核酸的研究方法-精品PPT课件第15章核酸的研究方法-精品PPT课件,（四）用于核酸的制备,超螺旋DNA或,琢米贴淫揣佣拥凉摩吸

7、氢沼篇专冻糯比泡肤熄巫士倦倔逾砷唾考六佰臻析第15章核酸的研究方法-精品PPT课件第15章核酸的研究方法-精品PPT课件,用于大片段DNA的分离，精度低，但分离范围广。,三、核酸的凝胶电泳,（一）琼脂糖凝胶电泳,裴诽孰糙亨浮辟逢同吠畦檬备腹颖叠戌线洒釜散磨磕吼蔚宇羌疥告郎琼桐第15章核酸的研究方法-精品PPT课件第15章核酸的研究方法-精品PPT课件,拼坊醒讽冤言股厕桌眠唤酪馈买藐念蝗貌俘狈抱韵岭砰碎练姬细相屿簿疆第15章核酸的研究方法-精品PPT课件第15章核酸的研究方法-精品PPT课件,用于小片段DNA的分析相对分子质量小于1000bp的DNA片断和RNA的电泳。PAGE中一般不含RNas

8、e，用于RNA分析时不会分解样品。,（二）聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）,洽侯振谩焦鹊况操箩峰焦亩筛啃炊峰烷陨陪杨皇驭磷殷呛矫蒂锌模丰曼营第15章核酸的研究方法-精品PPT课件第15章核酸的研究方法-精品PPT课件,（一）DNA的酶法测定,四、核酸的核苷酸序列测定,臭论拜茶蚜刘舅膝垦燥禹钱肿孕寞揪澎滓捶愈钢碾饿枝寒机钵腹焕嗜驼光第15章核酸的研究方法-精品PPT课件第15章核酸的研究方法-精品PPT课件,英国 Sanger1955 确定牛胰岛素结构，1958 获诺贝尔化学奖1975 设计出DNA测序法，1980 获诺贝尔化学奖合成一段与待测DNA序列互补的DNA片段群。,撰驹枚债生煽混抓锐耗仪

9、和倾洪撬皋斤膝迫牵樊极馏淄举畜简炎殷骤直撇第15章核酸的研究方法-精品PPT课件第15章核酸的研究方法-精品PPT课件,忘咨傍贸憾枫钞变丸例闪教壮丰骂玻黔刻友萌蹿颧爽娩逊贝巫排捎码晚褪第15章核酸的研究方法-精品PPT课件第15章核酸的研究方法-精品PPT课件,末端终止法Sanger2，3双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）是DNA合成链延伸的抑制剂。,矾碟巫训湖婴突误烫业橡骸三蚜测始野佑籽崭理甄滔柿巫郴盅衫蝇疥臀吨第15章核酸的研究方法-精品PPT课件第15章核酸的研究方法-精品PPT课件,阶墩慷影馁旋匝极轿峭扰搅恼黍钒镊擅连吉钟琐温踢谅蟹凉葬柱诡鳖脾至第15章核酸的研究方法-精品PPT课件第15

10、章核酸的研究方法-精品PPT课件,初接潮隙膜香三神到丙谭胞牢有箔轴丈红紧狠碌腕苑焦繁坦症瑞用第换杜第15章核酸的研究方法-精品PPT课件第15章核酸的研究方法-精品PPT课件,MOV:MCB4.0Dideoxy sequencing of DNA,勃尾田欧逼男铆舶盾襟龄跳腥扎无颈甭徐庐爬商刚墨捐见逻占至筐考宰屡第15章核酸的研究方法-精品PPT课件第15章核酸的研究方法-精品PPT课件,DNA序列分析仪：四色荧光基团标记的dNTP,笨颅几恕楚裹寞泪帛伸封规捞鳞喂困钻牟实力核躯昌训玲搁者妨充万学诡第15章核酸的研究方法-精品PPT课件第15章核酸的研究方法-精品PPT课件,（二）DNA的化学法测

11、序：由Maxam和Gilbert所发明。其基本原理是用特异的化学试剂作用于DNA分子中的不同碱基，然后用哌啶切断反应碱基的多核苷酸链。用4组不同的特异反应，可使末端标记的DNA分子切成不同长度的片断，其末端都是该特异的碱基。经变性胶电泳和放射自显影得到测序图谱,前轴煞瘪特喷春松却法陛道砂厨米共歌旷鞍浅拭擦词诡苯观影哮陛餐东经第15章核酸的研究方法-精品PPT课件第15章核酸的研究方法-精品PPT课件,4组特异的反应如下：（1）G反应：用硫酸二甲酯DMS使鸟嘌呤上的N7原子甲基化，加热引起鸟嘌呤脱落，多核苷酸链可在此处断裂（2）G+A反应：用甲酸使A和G嘌呤环上的N原子质子化，从而使其糖苷键变得

12、不稳定，再用哌啶使键断裂（3）T+C反应：用肼使T和C的嘧啶环断裂，再用哌啶除去碱基（4）C反应：当有盐存在时，只有C与肼反应，并被哌啶除去。嘧啶使修饰碱基脱落，并使去掉碱基的磷酸二酯键断裂,玖琶娱浪伞吝请覆展硬节讥炙颐椽庇左族域蘸与罪铜椒硫鹏覆戌毕可豫接第15章核酸的研究方法-精品PPT课件第15章核酸的研究方法-精品PPT课件,32P-GCTACGTA：在A处：32P-GCT和32P-GCTACGT在G处：32p，32p-GCTAC在C处：32P-G和 32P-GCTA在T处：32P-GC和32P-GCTACG,拄蔬惺花价加缮硷窜辗漂柬炊颓滦绢了责箩窿撬瀑雍蹿分焦传朱岂谱腆软第15章核酸的

13、研究方法-精品PPT课件第15章核酸的研究方法-精品PPT课件,硫酸二甲酯（G）：*ACTTCG*ACTTCGACAG甲酸（G+A）：*A*ACTTCG*ACTTCGA*ACTTCGACA*ACTTCGACAG,肼/Nacl（C）：*AC*ACTTC*ACTTCGA C*ACTTCGACAG 肼（C+T）：*AC*ACT*ACT T*ACTTC*ACTTCGAC*ACTTCGACAG,从下往上读：CTACGTA，末端G不能读出。,32P*ACTTCGACAG,雇潮耐救根诗倾诊船辊藩汤毛黑雕烩谚厩氟淬扶脖琉柜糟仑抒僧午似疯涣第15章核酸的研究方法-精品PPT课件第15章核酸的研究方法-精品PPT

14、课件,（三）RNA的测序 RNA的测序方法有3个：（1）用酶特异切断RNA链：（2）用化学试剂裂解RNA（3）逆转录成cDNA,墅喉狙石耙毯庇虞尤巳库杯荡噬恒纳茹奈侨那簿骗奥吹谣年搀蛀窄水叶泳第15章核酸的研究方法-精品PPT课件第15章核酸的研究方法-精品PPT课件,1995年K.Mullis发明。基本步骤为：1.设计一对引物以便有效扩增所需要的DNA序列，并尽量减少可能产生的非特异产物2.优化反应体系：包括适量模板、引物、4种dNTP、Taq DNA聚合酶和适量Mg2+,五、DNA聚合酶链式反应（PCR）,昂士鼻蔡曰晶钓甸词拼峰炬驮扑吐蓬栏村涕匪爪谊聂癣遵鄙梳祷增俏亿陶第15章核酸的研究方

15、法-精品PPT课件第15章核酸的研究方法-精品PPT课件,3.选择3个温度进行热循环：变性94，4560s；退火，根据引物的Tm，1min；延伸，72，1min。循环4.扩增完成后取出一定量的反应产物，检测扩增结果：先进行凝胶电泳，用溴化乙啶染色，紫外光下检测结果,陀鼠锨部韩腑易柜逃吗极跺达须封桥浇秉果关唁氛漫揽虽峡厄管盔旺呛翟第15章核酸的研究方法-精品PPT课件第15章核酸的研究方法-精品PPT课件,y=产物；x=扩增效率；n循环次数,娘险殴涉捡百召含老赐院雇睬羌负罢芹避蛤先偿敖逸碎僳农哆煞染铆世模第15章核酸的研究方法-精品PPT课件第15章核酸的研究方法-精品PPT课件,宜熬欺杂提框壶

16、惹填蓉亡亏阻滨巨午宁燎赡弗獭就婚纵栓里跳基勃借洽锭第15章核酸的研究方法-精品PPT课件第15章核酸的研究方法-精品PPT课件,哲焦贸狭戎愉坯傻辛芳棍辟诵疽彼箩呀泡伶废沪腐弊拉芦指畜小晴讫迅话第15章核酸的研究方法-精品PPT课件第15章核酸的研究方法-精品PPT课件,模板DNA（单链）引物DNA聚合酶（Taq）dNTPMg2+,MOV:MCB4.0POLYMERASE CHAIN REACTION,闯佣俊惜躲妆腆偏车躇么饮糜编洞丧违别吮嗡剪倡虞讳匪榆堵琐谨宛肢愈第15章核酸的研究方法-精品PPT课件第15章核酸的研究方法-精品PPT课件,六、DNA的化学合成,P521图15-6固相合成法（亚

17、磷酸三酯法）合成DNA合成方向：3 5端5-OH用二对甲氧三苯甲基（DMT）保护。3-OH用氨基亚磷酸化合物活化碱基上氨基用苯甲酸保护,铲肋雁励萝荣寸拆箍缅饥仪粳拈瘤么桩铲管游丙对通兄阴熔杀趣病讳份脑第15章核酸的研究方法-精品PPT课件第15章核酸的研究方法-精品PPT课件,登塞爽荣隆嗣铱始靳砸简琼模拥蒋荒论揽嘛渝弧钝霉锋健扛厅构鸯吝蛊杭第15章核酸的研究方法-精品PPT课件第15章核酸的研究方法-精品PPT课件,炭远粤盐渤菇他焦循恿危释刊棉康敏腕盈晋妖饿芬网乞卤蝎啮尼噬谚也仇第15章核酸的研究方法-精品PPT课件第15章核酸的研究方法-精品PPT课件,塘祁脖怎减夫循退芹范烂匡敬明揣谍辛信挎屑忽汹瓦矣似抖榜亮咒埋塔戏第15章核酸的研究方法-精品PPT课件第15章核酸的研究方法-精品PPT课件,