禽蛋中卵黄免疫球蛋白的测定高效液相色谱法编制说明.docx

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1、中华人民共和国农业行业标准禽蛋中卵黄免疫球蛋白的测定高效液相色谱法（征求意见稿）编制说明禽蛋中卵黄免疫球蛋白的测定高效液相色谱法编制小组2023年10月禽蛋中卵黄免疫球蛋白的测定高效液相色谱法编制说明一、工作简况，包括任务来源、制定背景、起草过程等(一)任务来源本标准根据2020年农业农村部农产品质量安全监管司下达工作任务安排,项目下达文件号农质标函2020128号，项目计划号农质标函2020128号202065,在参考国内外有关免疫球蛋白测试分析方法的基础上结合前期研究基础及我国生产检验中的实际情况，由XXXX作为本标准负责起草单位，XXX教授为项目的首席专家。(二)制定背景1、测定禽蛋卵黄

2、免疫球蛋白IgY的意义国际上从上世纪70年代就开始研究从牛奶、乳清、初乳和血液中提取免疫球蛋白G(IgG)的技术和工艺，但由于资源不足，免疫球蛋白资源的开发一直没有重大的进展。禽蛋蛋黄中的免疫球蛋白Y(ImmunoglobulinofYolk,IgY)由于在被动免疫治疗中独特优势，逐渐被关注和研究。IgY是禽类通过免疫系统自然生产的抗体，蓄积于禽蛋蛋黄中，来源天然健康；其通过免疫反应产生的特异性IgY抗体能针对特定病原体的多个抗原表位，不会引起病原微生物的特异性抗性，也不会影响宿主体内微生物菌群的架构；从生物学角度来讲，人与禽的亲缘关系较远，存在人和禽共患疾病的机率也较小，因此，与同种属或相近

3、动物的IgG相比，IgY有更好的特异性和敏感性。与哺乳动物的IgG相比，IgY具有更好的局部活性和更强的抗原结合力。禽蛋中IgY的含量与禽蛋类别、饲料组成、蛋禽日龄有一定的关系。近几十年,各国学者开始研究从禽蛋卵黄中分离纯化ig,禽蛋成为提取免疫球蛋白的最佳资源，母禽被称为高效率、高质量的抗体生产厂。IgY提取技术已被公认为是从哺乳动物血液中获取抗体的最佳替代手段，然而，该技术至今未能获得大规模的推广和应用，其主要原因在于IgY的分离纯化以及定量分析较为困难，缺乏可依据的标准。2、禽蛋中卵黄免疫球蛋白IgY提取富集的方法卵黄中水分约占48%,蛋白质约占18%,脂类约占30%,其中大部分脂肪与蛋

4、白质以脂蛋白的形式存在。IgY是存在于蛋黄中的水溶性蛋白质，其总量仅为蛋黄固形物的10%。实现IgY的富集必须去除大部分的低密度脂蛋白。传统方法通过水稀释、有机溶剂、非离子型表面活性剂等方法净化基质，分离卵黄中的脂类和免疫球蛋白。不同的前处理方式，禽蛋IgY的检测结果有一定的差异。并且不同的禽蛋晶种，不同的蛋龄甚至饲料都会引起IgY的含量差异。因此，目前急需要建立一种简单高效的禽蛋蛋黄前处理方法，为进一步的IgY分析测试奠定基础。水稀释法是1992年首次提出用于蛋黄液中亲水性和疏水性组分的分离。即将蛋黄液加水稀释一定倍数，调节溶液PH值，混匀静置后离心分离，根据脂蛋白不溶于水这一特性，使脂蛋白

5、聚集沉淀，获得含IgY的上清液。对水稀释法进一步进行技术优化，可以达到分离步骤简单、快速、脱脂效率高，实现绿色环保，低成本的分离富集卵黄免疫球蛋白。3、卵黄免疫球蛋白IgY的分析方法IgY与IgG在结构与性质上都有一定的差异，IgG主要来源于动物的血清，而IgY主要来源于禽蛋黄。我国尚缺少针对禽蛋中IgY的定量检测的分析方法。目前国内只有针对保健食品、饲料、乳制品中IgG的检测标准方法，结果见表1。表1免疫球蛋白的测定方法标准名称标准名称方法状态1保健食品中免疫球蛋白IgG的测定GB/T5009.194-2003亲和色谱-UV有效2饲料中免疫球蛋白IgG的测定高效液相色谱法GB/T21033-

6、2007亲和色谱UV有效3牛初乳及其制品中免疫球蛋白IgG的测定分光光度法NY/T2070-2011分光光度法有效4出口牛乳制品中牛免疫球蛋白G的测定能联免疫吸附法SN/T3132-2012酶联免疫吸附法有效5牙膏中蛋黄球蛋白（IgY）活性效价测定方法QB/T4363-2012酶联免疫吸附法有效6奶及奶制品中免疫球蛋白IgG的测定高效液相色谱法T/TDST1A003-2021液相色谱法有效7乳及乳制品中免疫球蛋白IgG的测定（高效液相色谱法）T/SSFS0002-2021液相色谱法有效由表可知GB/T5009.194-2003保健食品中免疫球蛋白IgG的测定，采用免疫亲和色谱，利用Hi-Tra

7、pproteinG色谱柱进行IgG的特异性吸附和纯化，紫外作为检测器。GB/T21033-2007,使用同样的方法测定饲料和含IgG的饲料原料中的IgG含量，该方法最低检出限为5ggNYT207020U测定牛初乳及其制品中免疫球蛋白IgG含量，该标准提供了IgG的紫外分光光度定量分析方法，方法简单，试剂常见，成本低廉，然而该方法只适用于基质简单的体系和IgG含量大于0.2mg/mL的牛初乳及其制品中IgG的测定，对IgG含量较低的的样品无法进行定量分析。SN/T3132-2012出口牛乳制品中牛免疫球蛋白G的测定采用酶联免疫吸附法对牛乳制品中免疫球蛋白含量进行了分析，但是该方法操作步骤繁琐，耗

8、费时间比较长，回收率并不理想，且使用的试剂较为昂贵。TTDSTIA0032021奶及奶制品中免疫球蛋白IgG的测定高效液相色谱法、T/SSFS0002-2021乳及乳制品中免疫球蛋白IgG的测定（高效液相色谱法）近几年的行业协会组织制定的行业标准逐渐开始采用更加简洁高效，易于操作实现的液相色谱法进行乳制品中免疫球蛋白IgG的测定，具有灵敏快速的特点。由于禽蛋蛋黄中蛋白质和脂质含量高，脂蛋白、脂质、小分子物质与水溶性IgY共存，形成均一的乳化体系，样品背景基质比较复杂，分离纯化有一定难度。如果采用较复杂精细的前处理纯化步骤，又势必引起IgY的损失。因此，本标准建立了一种简洁有效的前处理技术，结合

9、液相色谱高效分离与高灵敏的快速检测，实现对禽蛋蛋黄中IgY的定量分析。结合本团队十儿年的研究经验，我们研究发现了一种简单高效的蛋黄前处理技术，利用纯水作为分离介质，实现水溶性IgY与非水溶性组分的分离，采用超声分散技术加快相分离。调节组分PH值分离沉淀水溶性的脂蛋白，优化了相分离的温度与时间，使基质的脱脂率达到99%以上，IgY的富集效率大大提高。经离心分离、脂质净化和过滤膜后，可直接上样分析。在色谱分析方法的选择上，亲和层析色谱分离效果较好，广泛应用于IgG检测，但是操作繁琐，分析时间较长，并且不适合批量测试。本标准没有采用目前主流的亲和柱进行分离富集的原因是目前市面上常用的亲和层析填料是免

10、疫球蛋白结合蛋白A和蛋白G,通过与Fc域结合来纯化抗体IgA和IgGo但是，由于氨基酸序列和构象的差异，这两种结合蛋白对卵黄免疫球蛋白IgY没有亲和力。针对IgY的特异性配基填料研发较少，柱成本非常昂贵而且性能不稳定。在结合本团队十多年的研究基础上，经过试验分析，我们发现水稀释法样品前处理结合尺寸排阻色谱对IgY的分离效果非常理想，结合紫外，可实现快速灵敏对禽蛋中IgY含量进行定量检测，具有检测速度快，灵敏度高特点，并且实验操作简单，所用试剂耗量小、成本低，易于批量生产。(三)起草过程1、起草阶段2019年7月，项目下达后，按照项目任务书的要求，我们积极组织人员成立标准编制工作小组。标准的编制

11、组成员包括项目承担单位XXXX标准化制定人员，同时吸收了XXXX等相关标准编制人员，负责标准的信息调研与收集、整理和编制工作。具体人员分工见表2。表2主要参与人员任务分工表2020年7月-9月，标准编制小组查阅了大量文献，根据本团队前期研究基础，针对禽蛋中卵黄免疫球蛋白IgY的提取和检测条件作了优化，并测定了蛋黄中IgY的工作曲线、精密度与回收率，形成标准初稿。根据所搜集到的资料以及实验结果，在科学、先进、实用的原则下，标准编制小组根据这些结果起草了标准草案。标准编制组起草人员经共同研究，根据讨论的意见，撰写了标准征求意见稿。2020年9月-10月，选定XXXX对初步形成的禽蛋中IgY的测定液

12、相色谱法进行验证，确定相关指标参数，起草小组对标准文本和编制说明进行多次修改，形成征求意见稿。2、定向征求意见2020年11月，标准编制组定向在行业内组织征求意见工作，包括食品检测管理部门、蛋品加工企业，检测机构以及高校等多家机构，截至2020年12月，共征集29个单位的意见，其中检测机构21家，企业5家，高校3家，收回22个单位的有效建议75条。征求意见主要人员见表3。标准编制组对所征集的建议进行了慎重的考虑和分析，采纳61条，部分采纳1条，不采纳13条。根据反馈的意见和建议,标准编制小组对标准草案做了适当修改，形成标准征求意见稿。根据反馈的意见进行了修改，形成标准预审稿。表3定向征求意见的

13、单位及个人信息汇总表类别序号姓名单位职称（务）研究所1彭毛武汉市粮油食品中心检验站工程师高校2何瑜湖北大学副教授研究所3钟书华鄂州市环境保护检测站工程师高校4沈晓芳江南大学教授高校5刘丽莉河南科技大学教授高校6耿放成都大学教授企业7许太基谱尼测试集团深圳有限公司实验室经理/工程师研究所8卢体康深圳海关动植物检验检疫技术中心中心主任/高级兽医师研究所9吴凤琪深圳海关食品检验检疫技术中心兽药残留科科长/高级工程师研究所10邓梦雅深圳市计量质量检测研究院检验员/工程师企业11姜学涯深圳凯吉星农产品检测认证有限公司副总监/工程师企业12张岩深圳中检联检测有限公司实验室有机主管/工程师研究所13周芳梅广

14、东省质量监督食品检验站副站长/高级工程师研究所14伍宏凯广东省农产品质量安全中心科长/兽医师研究所15沈详广农业农村部畜禽产品质量监督检验测试中心（广州）检测室主任/高级兽医师企业16刘磊深圳三方圆检测监管服务有限公司分析检测部经理/高级工程师企业17谢冬霞深圳三方圆检测监管服务有限公司副总经理/工程师研究所18姜杰深圳市疾病预防控制中心理化检测所副所长/正高级主任技师企业19陈炜光深圳市绿诗源生物技术有限公司区域总经理/工程师3、预审阶段2023年3月160,XXXX组织专家对XXXX等单位起草的农业行业标准禽蛋中卵黄免疫球蛋白的测定高效液相色谱法（预审稿）进行了认真审查。专家组由曾勇、张莉

15、、李会荣、夏虹、彭大鹏、陈世桢、李婷婷组成。在听取起草专家汇报的基础上，专家组审查了标准文本及编制说明，专家一致审查通过，并提出如下修改意见：进一步完善编制说明，补充线性范围，鸡蛋、鸭蛋、鸽蛋、鹤鹑蛋的空白、定量限、添加回收等数据和图谱。验证报告补充线性范围、检出限、定量限、不同基质中添加回收等数据和图谱。补充完善色谱柱、波长、离心速度及时间的优化数据。按GB/T1.1-2020和GB/T20001.4-2015的要求进一步规范标准文本。专家意见汇总处理表见附件。4、公开征求意见阶段。2023年4月7月，根据预审稿专家意见，标准编制小组根据本团队前期研究基础，针对禽蛋中卵黄免疫球蛋白IgY的提

16、取和检测条件继续作了优化，并扩充了不同的基质的检验情况，同时增大了抽样选取的范围以及批次，根据优化条件，重新测定了蛋黄中IgY的工作曲线、精密度与回收率，修改了标准文稿，并重新选定农业农村部家禽品质监督检验测试中心（扬州）、农业农村部畜禽产品质量监督检验测试中心（广州）、谱尼测试集团深圳有限公司等三家检验机构对不同基质的禽蛋中IgY的液相色谱法测定进行了验证，三家验证报告覆盖了鸡蛋、鹤鹑蛋、鸽子蛋、鹅蛋、鸭蛋等市面上常见禽蛋基质，确定相关指标参数，形成修改后的验证报告以及编制说明。2023年8月，编制小组按照预审专家提出的修改意见对标准材料进行进一步的完善，形成了公开征求意见稿。二、国家标准编

17、制原则、主要内容及其确定依据，修订国家标准时，还包括修订前后技术内容的对比（一）标准的编写原则本标准制定遵循“先进性、实用性、统一性、规范性”的总原则，注重标准的通用性、适用性、先进性和可操作性。本标准制定以简化卵黄免疫球蛋白的提取程序，节约时间、提高效率和提高测试方法的准确度、精密度、检测限和定量限为基本原则，严格按照GB/T1.1-2020标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则和GB/T2000142015标准编写规则第4部分：试验方法标准的要求进行制定。本标准制定过程中力求做到技术内容的叙述正确无误，文字表达准确、简明、易懂；标准的构成严谨合理，内容编排、层次划分符合逻辑与规

18、定。（二）主要技术内容确定依据1、样品基质的选择为了充分比较不同禽蛋中免疫球蛋白IgY的含量，分别采集了鸡蛋、鸭蛋、鹅蛋、鹊鹑蛋、鸽子蛋样品作为检测基质和验证材料样品基质。2、样品提取净化条件的确定卵黄中水分约占48%,蛋白质约占18%,脂类约占30%,其中大部分脂肪与蛋白质以脂蛋白的形式存在。IgY是存在于蛋黄中的水溶性蛋白质，其总量仅为蛋黄固形物的10%。实现IgY的富集必须去除大部分的低密度脂蛋白。传统方法通过水稀释、有机溶剂、非离子型表面活性剂等方法净化基质，分离卵黄中的脂类和免疫球蛋白。不同的前处理方式，禽蛋IgY的检测结果有一定的差异。并且不同的禽蛋品种，不同的蛋龄甚至饲料都会引起

19、IgY的含量差异。因此，目前急需要建立一种简单高效的禽蛋蛋黄前处理方法，为进一步的IgY分析测试奠定基础。水稀释法是一种利用水分离蛋黄液中亲水性和疏水性组分的方法。即将蛋黄液加水稀释一定倍数，调节溶液PH值，混匀静置后离心分离，根据脂蛋白不溶于水这一特性，使脂蛋白聚集沉淀，获得含IgY的上清液。对水稀释法进一步进行技术优化，可以达到分离步骤简单、快速，脱脂效率高；（2）使用水作为绿色环保，成本低；（3）不添加化学试剂，不损害IgY活性，安全性高。调节PH分寓长客度感芟自 稀峰妥黄濠冷藏静置超声分散本净化过程即采用水稀释法，并在此基础上进行了改良优化，过程如图1所示,优化了水稀释倍数、pH、静置

20、时间、离心转速以及溶剂净化等条件。合适的温度、足量的时间，破杯受白肢来促进上样分析充分进行三相分M晏白学出图IIgY前处理技术路线（1）稀释倍数优化1.1 鸡蛋稀释倍数根据脂蛋白不溶于水的特性，将蛋黄溶于水，使脂蛋白聚集沉淀，获得含IgY的上清液。从试验结果看出，随稀释倍数的增加，蛋白质浓度逐渐减少，透光率和除脂率逐渐增加，上清液变得更澄清，透光率在稀释10倍后无显著变化。特别是,当稀释倍数从4到5倍时上清液中脂肪含量迅速减少，透光率变化非常显著，当稀释倍数达到8倍以上时，除脂率达到99%以上。电泳结果显示当稀释倍数较低时，蛋白质组分中有较多杂蛋白，而随着稀释倍数升高，上清液中杂蛋白逐渐消失。

21、综合以上结果，稀释10倍是分离鸡蛋中IgY的最适条件。图2稀释倍数对鸡蛋IgY提取液蛋白浓度（八）、透光率（B）、除脂率（C）和SDS-PAGE（D）的影响（4-12分别表示稀释倍数）1.2 鹳鹑蛋稀释倍数图3稀释倍数对鹤鹑蛋IgY提取液蛋白浓度（A）、透光率（B）、除脂率（C） 和SDS-PAGE （D）的影响（4-12分别表示稀释倍数）从试验结果看出，随稀释倍数的增加，蛋白质浓度逐渐减少，透光率和除脂率逐渐增加，上清液变得更澄清，特别是稀释倍数从6到8倍时，变化非常的显著。稀释倍数8倍以上，除脂率能达到99%以上。通过电泳条带也可清晰看到，IgY在250kDa附近的条带较清晰，稀释倍数8倍

22、以上时可达到较好的分离效果。1.3 鹅蛋稀释倍数从试验结果看出，随稀释倍数的增加，蛋白质浓度逐渐减少，透光率和除脂率逐渐增加，上清液变得更澄清，特别是稀释倍数从6到8倍时，变化非常的显著。稀释倍数10倍以上，除脂率能达到99%以上。通过电泳条带也可清晰看到，随着稀释倍数升高，上清液中杂蛋白条带逐渐消失，IgY在250kDa附近的条带也越清晰，稀释倍数10倍以上时可达到较好的分离效果。图4稀释倍数对鹅蛋IgY提取液蛋白浓度（八）、透光率（B）、除脂率（C）和SDS-PAGE（D）的影响（4-12分别表示稀释倍数）1.4鸽子蛋稀释倍数从试验结果看出，随稀释倍数的增加，蛋白质浓度逐渐减少，透光率和除

23、脂率逐渐增加，上清液变得更澄清。稀释倍数10倍以上，除脂率能达到98.8%以上。通过电泳条带也可清晰看到，随着稀释倍数升高，上清液中杂蛋白条带逐渐消失，IgY在250kDa附近的条带也越清晰，稀释倍数10倍以上时可达到较好的分离效果。图5稀释倍数对鸽子蛋IgY提取液蛋白浓度（八）、透光率（B）、除脂率（C）和SDS-PAGE（D）的影响（4-12分别表示稀释倍数）1.5 鸭蛋稀释倍数图6稀释倍数对鸭蛋IgY提取液蛋白浓度（八）、透光率（B）、除脂率（C）和SDS-PAGE（D）的影响（6-14分别表示稀释倍数）从试验结果看出，随稀释倍数的增加，蛋白质浓度逐渐减少，透光率和除脂率逐渐增加，上清液

24、变得更澄清，特别是稀释倍数从8到10倍时，透光率变化非常的显著。稀释倍数10倍以上，除脂率能达到99%以上。通过电泳条带也可清晰看到，随着稀释倍数升高，上清液中杂蛋白条带逐渐消失，稀释10倍时，IgY在25OkDa附近的条带较清晰。综合上述不同品种禽蛋的稀释倍数的条件考察，最终选择采用10倍的稀释率。以免疫球蛋白含量最低的鸭蛋作为基质，采用10倍的水稀释率，进一步优化后续前处理步骤。（2）pH优化有研究表明，蛋白质之间的相互作用和聚合行为受PH值影响较大，水稀释法提取IgY时，调节PH至蛋白质的等电点5.05.4附近可以增强杂质蛋白的沉降，从而获得纯度更高的IgY水溶液。由图可知，PH值在5.

25、05.4之间时水溶性组分中蛋白浓度较低，有利于杂蛋白的沉降，并且透光率较高，除脂率可达99%以上。SDS-PAGE结果显示在PH5.05.4时杂蛋白条带较浅。综合以上结果表明，PH5.05.4是分离IgY的最适条件。图7pH对鸭蛋IgY提取液蛋白浓度（八）、透光率（B）、除脂率（C）和SDS-PAGE（D）的影响（1-8分别表示不同pH4.6,4.8,5.0,5.2,5.4,5.6,5.8,6.0）（3）静置时间优化蛋白质与酸作用需要一定时间。从试验结果看出，静置时间从4到6h时，蛋白浓度、透光率、除脂率变化最大，延长静置时间，变化较缓慢；除脂率在静置6h图8静置时间对鸭蛋IgY提取液蛋白浓度

26、（八）、透光率（B）、除脂率（C）和SDS-PAGE（D）的影响（4-12分别表示静置时间）（4）离心转速优化图9离心转速对鸭蛋IgY提取液蛋白浓度（八）、透光率（B）、除脂率（C）和SDS-PAGE（D）的影响（1-5分别表示离心转速5000、5500、6000、6500、7000rmin）离心力的变化对蛋黄颗粒的去除有一定影响，离心力越大，沉淀的蛋黄颗粒越多，而当离心力增加到一定程度时，蛋黄颗粒的沉淀量会达到峰值。从试验结果看出，离心转速对蛋白浓度影响不大；透光率在离心转速6000r/min以上基本不变；除脂率在离心转速6000r/min以上基本不变，能达到99%以上。通过电泳条带也可清晰

27、看到，离心转速6000r/min以上时，IgY在250kDa附近的条带较清晰，杂蛋白条带较浅。（5）溶剂净化优化进一步优化不同浓度盐溶处理和正己烷两种方式净化样品溶液。从试验结果看出，正己烷处理效果比盐溶处理效果更好。在蛋白质水溶液中，加入少量的中性盐,会增加蛋白质在水溶液中的溶解度，这种现象称为盐溶。从实验结果看出，在5ml上清液中加入少量NaC1,溶液的透光率会增大。当加!入0.06gNaCl（0.21molL）时，溶液的透光率最大，从宏观图也可看出此时溶液最澄清。正己烷能够净化水溶液中的脂质。从实验结果看出，加入正己烷（1：5V:V）显著提高了样品溶液的透光率,溶液变得更澄清，各组别之间

28、无明显差异。NiClMirtt (nolX(/) *?检2:19 M 4ti Ol 6;10rfidfic 液（VA ）(/)*三石图10对鸭蛋IgY提取液进行盐溶处理和正己烷处理优化。盐溶处理优化：透光率（八）,宏观图（B）；正己烷处理优化：透光率（C）,宏观图（D）经过优化后的具体方法如下：在同一批次中取6个10个禽蛋样品，鸽蛋、鹊鹑蛋可适当增加样品数量。洗净去壳，分离蛋清蛋黄，将蛋黄置于滤纸上轻轻滚动吸去蛋黄膜上附着的蛋清，用镜子刺破蛋黄膜将蛋黄液收集于烧杯中，搅拌均匀后装入聚乙烯瓶中，作为待测试样，于4C条件下保存。在充分比较了水稀释倍数、pH、静置时间、离心转速以及溶剂净化对IgY的

29、提取效果的影响。并综合考虑实际操作情况，最终选择，按照质量比1:10以上的稀释率，调节PH为5.000.05,超声，4下冷藏静置12h,并6000r/min离心20min,取上清液用正己烷进一步净化后作为IgY的最佳分离提取条件。具体方法如下：准确称取试样2.00g(精确至0.0Ig)于25.0mL比色管中，加入纯水稀释并定容至25mL,振摇混匀后，用1.0OmOI/L盐酸调节PH至5.OOO.O5.冰浴条件下超声30min,04冷臧静置1211,离心(0C4C,6000rmin)20min,收集上清液，上清液中加入5.0OmL正己烷，振摇混匀后，离心(04,6000rmin)20min,弃去

30、上层正己烷，取IrnL2mL溶液过0.22m滤膜，所得滤液供高效液相色谱检测分析用。3、色谱条件的优化(1)检测波长的确定IgY作为一种大分子球蛋白，在紫外波长范围内，于20Onm与28Onm处均有吸收波长。由图11可知，波长为28Onm时所出的色谱法峰峰型尖锐、峰宽较窄，分离效率更高，因此本文件起草小组最终选择280nm作为检测波长。蛋白A和G通常用作免疫球蛋白结合蛋白(IBPS),通过与FC域结合来纯化抗体，例如IgG和IgA。但是，由于氨基酸序列和构象的差异，IBPS对卵黄免疫球蛋白IgY没有亲和力，市面上针对IgY的特异性配基填料研发较少，柱成本非常昂贵而且性能不稳定。尺寸排阻色谱作为

31、凝胶色谱的一种形式，是利用填料中固定相的孔隙来限制溶剂和溶质分子的进入，从而实现对分子的分离。在尺寸排阻色谱中，较大的分子能够顺利通过更大的孔隙，流速较快；而较小的分子则受到孔隙的限制J,流速较慢。通过分子的不同大小，尺寸排阻色谱可以用于分离蛋白质、聚合物、核酸等。结合本课题组前期工作中对鸡蛋卵黄免疫球蛋白含量的测定方法，筛选出TosohTSKgelSW3000xlBIoCoreSEC-300SAdvanceBioSEC300A三种凝胶渗透色谱柱来进行实验比较，IgY标准物质的出峰情况见图12。由图可知，AdvanceBioSEC300A柱所出图谱基线平整，分离度、峰形较好，没有明显拖尾，最终

32、选择AdvanceBioSEC300A作为本项目检测用色谱柱。(3)流动相和洗脱程序的选择本实验在阅读大量文献的基础上，采用优化后的前处理方法处理样品，在实际样品的检测中，使用AdvanceBioSEC300A色谱柱推荐流动相磷酸盐缓冲溶液作为流动相进行样品的分离，但如图13a所示，只使用磷酸盐缓冲溶液时鸡蛋实际样品所出峰形较差，于是在流动相中引入有机相进行等度洗脱，如图13b、13c所示，加入有机相后，鸡蛋实际样品的峰形得到大幅度改善，分离度上升，峰形尖锐。图13鸡蛋实际样品不同流动相色谱图（a.磷酸盐缓冲溶液、b.磷酸盐缓冲溶液+1%异丙醉、c.80%磷酸盐缓冲溶液+20%乙月青）流动相中

33、加入有机相能够大幅度改善色谱峰的峰形，鸭蛋基质在本实验中所用基质中峰形表现最差，故在AdvanceBioSEC3OOA色谱柱的承受范围之内加入不同浓度的乙般添加量探究其对峰形的影响。如图14所示，随着乙懵量的增大，鸭蛋基质的山峰情况得到明显改善，考虑到凝胶色谱柱的对有机相的耐受度，最后采用20%乙睛+80%磷酸盐缓冲溶液作为流动相。图14鸭蛋实际样品不同流动相色谱图（a.磷酸盐缓冲溶液、b.90%磷酸盐缓冲溶液+10%乙脐、c.85%磷酸盐缓冲溶液+15%乙晴、d80%磷酸盐缓冲溶液+20%乙脐）在流动相中加入Na2SO4有助于优化盐离子强度，加强IgY的分离，促进分析信号的增强。本实验探究加

34、入不同浓度的Na2SO4,对测定结果的影响，实验结果见表4o表44.00mg/mL的标准溶液在不同离子强度洗脱结果（流速0.8mLmin）Na2SO4浓度(mol/L)0.050.10.2洗脱时间（min）252525保留时间（min）8.1088.0798.121峰面积（mAU*s）496850624920峰高246.7247.5246.3由表4可知，4.00mg/mL的标准溶液含有0.1mol/LNa2SO4的磷酸盐缓冲液条件下响应较高，故选择含有0.1mol/LNa2SO4的磷酸盐缓冲液进行流速测试实验，测定结果见表5。表52.00mg/mL的标准溶液不同缓冲液流速洗脱结果（0.1mol

35、/LNa2SO4）缓冲液流速（mL/min）0.60.81.0洗脱时间（min）252525保留时间（min）11.4358.1056.656峰面积峰面积（mAU*s）375425911921峰高180.8134.492.5柱压（bar）97.6130.2171.6由表5可知，当流速为0.8mL/min时，柱压为130.2bar,AdvanceBioSEC300A色谱柱推荐柱压137bar,最终选择含有0.1mol/LNa2SO4W80%磷酸盐缓冲液+20%乙月青为流动相，0.8mL/min流速，等度洗脱。（4）绘制标准曲线在本测定标准中,准确称取0.500gIgY标准物质（纯度97%,称取精

36、确至0.0001g）,用流动相（0.ImoILNa2SO4磷酸盐缓冲液（pH6.6）溶解并定容至25.0mL,摇匀，配制成20.0mg/mL标准储备液，于18条件下避光保存备用，可使用1个月，用标准储备液稀释后立即配置、1个月后配置、2月后配置分别进行上样测试,测试结果见表6,色谱图见图15。由图表可知，用标准储备液稀释配置的2.00mg/mL的标准溶液其峰面积当日配置与一个月后配置之间没有太大的区别，2个月后配置峰面积略有下降，故本研究将储备液的储存时间定为1个月。表62.00mg/mL标准溶液峰面积数据配置时间当日1个月2个月峰面积mAU*s2704.031982734.350592619

37、.63696图152.00mg/mL标准溶液色谱图（a.当日配置、bl个月后配置、c.2个月后配置）通过流动相将储备液稀释为0.050、0.100、0.500、LO0、2.00、4.00mg/mL的系列IgY标准品并上样，以IgY标准溶液的浓度为横坐标，以其相应的峰面积为纵坐标，制作标准工作曲线，各标准溶液液相图谱和标准曲线图分别见图160本方法工作曲线为Y=I327.46845X+1.27635,R2=0.99999,线性范围为：0.05mg/mL-4.00mg/mLO图16标准曲线液相色谱谱图（a:0.05mg/mL、b:0.10mg/mL、c:0.50mg/mL、d:1.00mg/mL、

38、e:2.00mg/mL、f:4.0Omg/mL、g:校准曲线)(5)方法的检测限和定量限表720次平行测定禽蛋空白样品的结果测定次数空白峰面积（mAU*s）峰面积标准偏差1108.218642104.098593105.575594110367555110.496136110.777467118.585718118.636709115.9460110112.910965.1778611112.8962212112.8158313119.7538614119.8534515108.6677816108.3753217107.4024118106.9811319105.3924120104.265

39、40本研究采用了两种测定低限的实验方法。其一，如表7所示，对IgY含量最低的鸭蛋进行20次平行测定，以此所得到禽蛋空白值峰值的标准偏差为5.17786,图16中标准曲线的斜率为1327.46845。根据GB/T27404-2008附录F.4测定低限的公式计算得到测定低限（检出限）：（CL-方法的测定低限、Sb-空白值标准偏差、b方法校准曲线的斜率、VL提取体积、V2.移取体积、V3一定容体积）计算得到的本方法的测定低限0.012mg/go远低于多批次实验中，本底检测值最低的鸭蛋（约1.00mgg）,故无法通过实际样晶加标回收实验说明0.012mg/g可以为本方法的测定低限。其二，在本试验条件下

40、，将配置的0.05mg/mL的IgY标准溶液进行测定，如图17所示，得到信噪比（S/N）=95.2,根据检出限计算公式和样品前处理的稀释倍数,得出方法的检测限为0.0157mg/g,定量限为0.0525mg/g,同样远低于禽蛋中本底检测值最低的鸭蛋（约1.00mg/g）。故也没办法通过计算信噪比的方式来确定方法的检测限和定量限。（计算公式如下:检出限(MDL)(mgg)=3C(S/N)；定量限(MDL)(mgg)=10C(S/N)（C=加标浓度、SZN=信噪比）保留时间kmin信号含量Img/ml峰宽 塔板数 信号名称min噪声8.1371 4.94835e-20.2900436195.2 i

41、gy图17方法检测限图谱依据GBT27417-20175.4.1一需要评估检出限（LOD）和定量限（LOQ）的情况，通常情况下，只有当目标分析物的含量在接近于零的时候才需要确定方法的需要评估检出限（LoD）或定量限（LoQ）。当分析物浓度远大于LOQ时，没有必要评估方法的LOD和LOQoIgY是禽类通过免疫系统自然产生的抗体，蓄积于禽蛋蛋黄中，目前市面上所有的禽蛋均含有较高的IgY含量，没有绝对空白样品，故无需制定方法检出限（LoD）和定量限（LOQ）O综上所述，本标准拟不评估方法的检出限（LoD）和定量限（LOQ）。（6）实际样品测定从山东省烟台、湖北仙桃、江西赣州、广东东莞、广东清远、广东

42、惠州等供深禽蛋产地采购各种类型的禽蛋（鸡蛋、辐鹑蛋、鸽子蛋、鸭蛋、鹅蛋）各20批次,禽蛋黄样品按照IgY提取方式处理后得到粗提液，经滤膜过滤后进样液相检测。检测结果如表8所示。表8实际样品中IgY含量测定结果禽蛋种类IgY含量(mg/g)鸡蛋7.41-13.84鹤鹑蛋2.40-4.64鸽子蛋6.84-12.61鸭蛋1.00-1.71鹅蛋1.763.11由表中数据可以看出不同产地，根据其不同的养殖环境、饲养条件以及个体差异，IgY含量会产生较大的波动。为了解决这个问题，在本研究中，我们选择了不同批次禽蛋样品的中间值作为本底值，以进行加标实验。这种方法可以更准确地进行定量分析，以消除不同产地之间的

43、变异性。将鸡蛋本底值确定为10mg/g、鹤鹑蛋本底值为3mg/g、鸽子蛋本底值为Iomg/g、鸭蛋本底值为1.5mg/g、鹅蛋本底值为2.5mgg不同禽蛋基质样品图谱见图18。图18不同禽蛋实际样品液相色谱图（a:鸡蛋：b:鹳鹑蛋；c：鸽子蛋；d：鸭蛋：e:鹅蛋）（7）回收率及精密度准确称取禽蛋蛋黄液2.0Og（精确至0.0Ig）于25.0mL比色管中，蛋黄液中按0.5、1、2倍本底值的IgY标品添加量完成低、中、高三个的维度添加水平，加入纯水稀释并定容至25mL,振摇混匀后，用1.00mol/L盐酸调节PH至5.000.05o冰浴条件下超声30min,04冷藏静置12h,离心（0C4C,60

44、00rmin）20min,收集上清液，上清液中加入5.0OmL正己烷，振摇混匀后，离心（04,6000r/min）20min,弃去上层正己烷，取1mL2mL溶液过0.22m滤膜，所得滤液供高效液相色谱检测分析用，加标样品图谱见图19o在相同测定条件下检测各组样品中IgY的含量，重复测定6次，测定结果见表9、表10,结果表明，IgY的加标回收率范围为75O%105.3%,RSD为0.6%5.4%,相对标准偏差小于10%。方法的准确度和精密度符合原食药总局2017年第203号文附件食品补充检验方法研制指南的要求。表9不同禽蛋中IgY精密度检测记录表（n=6）添加 浓度 mg/g测定值（mg/g）平

45、均测定值（mg/g）RSD%4.2874.1654.2234.2734.1744.2014.2210.0511.28.0308.0278.1387.6737.6647.7337.8780.2112.715.88315.81715.63615.86116.03615.64615.8130.1521.01.5091.3461.4491.5111.5791.5051.4830.0795.42.7932.6562.9872.8652.7572.9792.8400.1304.65.1775.3335.3775.3875.3755.4315.3470.0891.74.3824.2934.2794.0224.0133.9824.1620.1754.38.2178.0847.8947.9908.1828.0878.0760.1201.516.00316.05816.04715.85515.86315.88615.9520.0940.610201.53651020鸡蛋鹤鹑蛋鸽子蛋0.750.6960.7000.6990.6960.6880.6870.6940.0060.8鸭蛋1.51