高良姜素对肺癌细胞H1299的抑制作用及机制研究.docx

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1、高良姜素对肺癌细胞H1299的抑制作用及机制研究廖秀珊海南博鳌一龄生命养护中心检验科，海南琼海571400【摘要】目的探讨高良姜素对肺癌细胞H1299的抑制作用及机制研究。方法取对数生长期的H1299细胞铺板于96孔板中，采用不同浓度高良姜素(0、2.5、5、10、20、40、80molL)处理24h,采用MTT法检测高良姜素对H1299细胞增殖的影响，计算半数抑制浓度(IC50),取0、1/2、1/4、1/8IC50(0、25、12.5、6.25molL)分为高、中、低剂量高良姜素进行后续实验，采用流式细胞术、免疫印迹法检测H1299细胞的凋亡率和Wnt3a、-catenin.Bax、Bcl

2、-2的蛋白表达。结果与对照组相比，580molL高良姜素细胞均可显著抑制肺癌细胞H1299细胞增殖，差异具有统计学意义(PBaX和Bcl-2蛋白表达水平分别为(4.23+0.45)%、(1.770.07)(2.510.15)(0.56+0.09)(1.890.12),6.25molL高良姜素细胞凋亡率、Wnt3a、-catenin.Bax和Bcl-2蛋白表达水平分别为(9.021.01)%、(0.970.11)(0.990.05)(0.890.04)(1.210.09),12.5molL高良姜素细胞凋亡率、Wnt3a、-cateninBax和Bcl-2蛋白表达水平分别为(18.482.33)%

3、、(0.560.07)s(O.88O.ll)s(1.210.1D(0.880.10),25molL高良姜素细胞凋亡率、Wnt3a、-catenin、Bax和Bcl-2蛋白表达水平分别为(26.441.17)%、(0.310.04)s(0.430.05)(1.790.21)、(0.280.07),与对照组相比，低、中、高剂量组高良姜素可促进细胞凋亡率增加，降低Wnt3a.-catenin和Bcl-2蛋白表达水平，升高Bax蛋白表达水平，差异具有统计学意义(P0.05)结论高良姜素可以抑制肺癌H1299细胞增殖并促进细胞凋亡，其机制可能与促进Bax的蛋白表达和抑制Wnt3a、-catenin和Bc

4、l-2的蛋白表达有关。【关键词】高良姜素；H1299肺癌细胞；细胞凋亡StudyontheinhibitoryeffectofgalanginonlungcancercellH1299anditsmechanism.LIAOXiu-Shan.DepartmentofLahoratoiyMedicine,HainanBoaoYilingLifeCareCenter,Qionghai571400,Hainan,China!AbstractObjectiveToexploretheinhibitoryeffectofgalanginonlungcancercellH1299anditsmechani

5、sm.MethodsTheH1299cellsinthelogarithmicgrowthphasewereplatedina96-wellplate,treatedwithdifferentconcentrationsofgalangin(0,2.5,5,10,20,40,80molL)for24h,andMTTwasusedtodetectgalangalcalculatethehalfinhibitoryconcentration(IC50)ofH1299cellproliferation,andtake0,1/2,1/4,1/8IC50(0,25,12.5,6.25molL)intoh

6、igh,medium,andlowthedoseofgalanginwasusedforfollow-upexperiments,andtheapoptosisrateofH1299cellsandtheproteinexpressionofWnt3a,-catenin,Bax,andBcl-2weredetectedbyflowcytometryandwesternblotting.ResultsComparedwiththecontrolgroup,580molLgalangincellscansignificantlyinhibittheproliferationoflungcancer

7、cellH1299cells(P0.05);calculatedbythefittingcurvemethod,galangin/Cso=5OmolL.0molLgalangincellapoptosisrate,Wnt3a,-catenin,BaxandBcl-2proteinexpressionlevelswere(4.230.45)%,(1.770.07),(2.510.15),(0.560.09),(1.890.12),6.25molLgalangincellapoptosisrate,Wnt3a,-catenin,BaxandBcl-2proteinexpressionlevelsw

8、ere(9.021.01)%,(0.970.11),(0.990.05),(0.890.04),(1.210.09),12.5molLgalangincellapoptosisrate,Wnt3a,-catenin,BaxandBcl-2proteinexpressionlevelswere(18.482.33)%,(0.560.07),(0.880.11),(1.210.11),(0.880.10),25molLgalangincellapoptosisrate,Wnt3a,-catenin,BaxandBcl-2proteinTheexpressionlevelswere(26.441.1

9、7)%,(0.310.04),(0.430.05),(1.790.21),(0.280.07).Comparedwiththecontrolgroup,thelow,mediumandhighdosesofAlpiniagingerItcanpromotetheincreaseofcellapoptosisrate,reducetheexpressionlevelofWnt3a,-cateninandBcl-2protein,andincreasetheexpressionlevelofBaxprotein.Thedifferencewasstatisticallysignificant(PB

10、aX和Bcl-2蛋白表达水平将细胞均匀铺于6孔板中，待细胞贴壁，观察细胞融合度，当细胞融合度达到8090%时，加入对照组、低剂量、中剂量和高剂量组的高良姜素处理H1299细胞24h后收集细胞总蛋白，采用BCA试剂盒法测定蛋白浓度。取30g蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）,湿转，5%BSA室温封闭1h,加入一抗Wnt3a（1：1000）、-catenin（1：1000）、Bax（1：IooO）和Bcl-2（1：1000）4孵育过夜，TBST洗膜3次，每次10分钟，加入二抗（1：5000）室温孵育2h,TBST洗膜3次，每次15分钟，利用化学发光液显影。采用ImageJ软件进行分析，

11、以目的蛋白/内参蛋白（GAPDH）的灰度值作为蛋白的相对表达量。1.6 统计学方法采用SPSSl9.0统计软件分析本研究中数据。符合正态分布的计量资料以平均值土标准差表示，组内比较采用配对r检验，多组间比较采用单因素方差分析并使用LSD-r法进行多重比较，不符合参数检验的数据比较采用秩和检验。P0.05表示差异具有统计学意义。2结果2.1 MTT检测不同浓度高良姜素对H1299细胞的生长抑制作用2.1.1 不同浓度高良姜素对H1299细胞的生长抑制作用不同浓度的高良姜素作用于肺癌H1299细胞24h后，高良姜素均可以抑制H1299细胞增殖（P0.05）,且随着剂量的增加，抑制增殖作用越强；同时

12、，高良姜素对肺癌H1299细胞的半数抑制浓度为50molL0选取0、25、12.5、6.25molL高良姜素进行后续实验。见表1。表1不同浓度的高良姜素对H1299细胞存活率的影响Concentration(molL)Survivalrate(%,xs)0100.000.792.597.642.37590.074.76*1080.881.37*2066.270.99*4054.272.17*8032.231.10*F121.232P0.05注：与OmolL相比，*P0.052.1.2 细胞形态变化光镜下观察可见随着高良姜素的浓度逐渐增加，细胞形态与对照组相比变小变圆数量逐渐增加，可见大量细胞脱

13、落，且细胞数量逐渐减少，同时细胞形态表现为不规则状态。其提示了高良姜素呈现剂量依赖性抑制肺癌H1299细胞增殖，（见图2）。0 molL 6,25 moL 12.5 molL 25 molL图2不同剂量的高良姜素对肺癌H1299细胞生长情况的影响（IOOX）2.2 高良姜素对HI299细胞凋亡的影响流式细胞术检测结果（图3和表2）显示，与对照（0molL）组相比，6.25、12.5、25molL的高良姜素处理细胞凋亡率显著增加（P,L &2S moll.0 . M X / -I2.S oLL| 25 molrL!jag I MB*I * gMK3/7图3不同浓度高良姜素对H1299细胞凋亡的影

14、响表2各组细胞凋亡率的比较Concentration(molL)Apoptosisrate(%,xs)04.23+0.456.259.021.01*12.518.482.33*2526.441.17*&F186.671P0.05注：与OmolL相比，*P0.05,与6.25molL相比，#P0.05,与12.5molL相比，&PBaX和Bcl2蛋白的影响与对照(0molL)组相比，6.25、12.5和25molL高良姜素处理肺癌H1299细胞后，Wnt3a、,catenin和BcL2蛋白表达水平显著降低，且具有剂量依赖性(P0.05);与对照(0molL)组相比,6.25、12.5和25mol

15、L高良姜素处理肺癌H1299细胞后，Bax蛋白表达水平显著增加，且具有一定的剂量依赖性(PBaX和Bcl-2的影响(%+S，n=5)Concentration(molL)Wnt3a-cateninBaxBcl-201.77+0.072.51+0.150.560.091.890.126.250.970.11*0.990.05*0.890.04+1.210.09*12.50.560.070.88+0.11*1.210.1*0.88+0.10*#250.310.04*m0.430.05*&1.790.21*&0.280.07*F23.37151.05337.12466.856P0.050.050.0

16、50.05注：与0molL相比，*P0.05,与6.25molL相比，#PVO.05,与12.5molL相比,&PcatcninBaxBd2GAPDH图4不同剂量高良姜素对Wnt3a、-catenin.BaX和Bcl-2的影响3讨论在传统的中草药中，高良姜素在早期的中医药治疗活动中主要用于抗诱变和抗病毒作用。近年来研究发现，高良姜素在多种癌细胞中显示出抗癌特性，包括人类乳腺癌症、结肠癌、胶质母瘤、肝细胞癌细胞网、早幼粒细胞白血病和前列腺癌细胞”纥然而，高良姜素对肺癌细胞H1299研究少有报道，且对于高良姜素抗肺癌的作用机制尚不明确，本文将通过高良姜素对肺癌H1299细胞的增殖活性、细胞凋亡和W

17、ntZP-Catenin信号通路的影响。有研究发现，高良姜素对人食管癌细胞系Eca9706、ECl09的体外研究表明,高良姜素可以显著抑制细胞生长，诱导细胞凋亡并阻止细胞周期进展，从而发挥抑癌作用。GWakM研究发现，高良姜素能够抑制大肠癌和肝癌细胞系的增殖，其下调了-catenin的细胞内水平和P-Catenin/TCF依赖性基因的转录，如CyClinDI和C-Myc。本文研究结果发现，高良姜素可以显著抑制肺癌H1299细胞的增殖，且呈现一定的剂量依赖效应抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡。贺文煜研究发现，高良姜素可以通过PI3KAKT信号通路抑制胃癌细胞增殖和诱导细胞凋亡，相关机制研究发现，其可能

18、的作用机制与促进Bax的表达和抑制Bcl-2的表达有关。研究表明，在细胞凋亡的发生发展过程中，BaX和Bcl-2蛋白的异常是促进细胞凋亡的关键因素叫其中高表达的Bax可以促进细胞凋亡，而高表达的Bcl-2则对细胞凋亡的进程起到抑制作用，从生理功能分析，这两个蛋白的生物学功能是相反的。相关研究发现，Bcl-2蛋白主要位于线粒体膜外，Bcl-2主要通过抑制内质网膜上的Ca?+释放和抑制线粒体细胞色素C的释放，进而达到抑制细胞凋亡U4。而细胞膜外的BaX蛋白则可以促进细胞色素C的分泌增加，进而通过CaSPaSe信号通路的激活促进细胞凋亡。通过本研究结果发现，高良姜素作用于肺癌H1299细胞后，Bax

19、蛋白表达水平显著增加，且具有剂量依赖效应，而Bcl-2蛋白表达水平则呈现显著下降的趋势，并具有一定的剂量依赖效应,这提示了高良姜素可以通过下调Bcl-2的表达和上调Bax的表达来诱发细胞凋亡。侯江雷研究发现，高良姜素可以抑制胶质母细胞瘤增殖和通过降低Bcl-2和升高Bax的蛋白表达水平诱导细胞凋亡，其可能的机制是通过抑制Wnt-catenin信号通过有关。Wm信号通路涉及许多生理过程，包括细胞增殖，胚胎发育和体内稳态。Wnt-catenin信号通路的异常激活与恶性肿瘤细胞的增殖、分化、侵袭和转移密切相关。Wm3a是WnI家族的主要成员，可以激活经典Wntp-catenin信号通路，而-cate

20、nin是Wnt-catenin信号通路的关键蛋白。当Wnt-catenin信号通路激活时，Wm3a将信号传递到胞质蛋白，使-catenin由细胞质转移到细胞核内，从而参与调节细胞凋亡相关蛋白的表达口儿李永峰1研究发现，高良姜素可以通过降低Wnt-catenin信号转导通路相关蛋白从而抑制乳腺癌细胞增殖和促进其凋亡，从而发挥抗癌作用。本文研究中，高良姜素呈剂量依赖性地抑制Wnt3a和-catenin蛋白的表达，提示了高良姜素可以抑制Wnt-catenin信号通路，这可能与高良姜素诱导肺癌细胞凋亡的潜在机制之一。综上所述，高良姜素可以抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡，其可能的机制是通过上调BaX蛋白和下

21、调BCl-2、Wnt3a和-catenin蛋白表达，从而抗癌作用。参考文献1 ABUBAKARIB,MALAMII,YAHAYAY,etal.Areviewontheethnomedicinaluses,phytochemistryandpharmacologyofAlpiniaOfTicinarumHanceJJ.Journalofethnopharmacology,2018,224:45-62.2 BACANLiM,BASARANAA,BA$ARANN.GalanginasaPlantPhenolicandUsageinHealthandDiseaseM.Polyphenols:Preve

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