第3章吸附层析.ppt

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1、色 谱（Chromatography),又称色层法或层析法,色谱历史,1903（1906）年，Michael Tswett提出色谱法1931年，Kuhn采用柱色谱分离了类胡萝卜素1941年，Martin和Synge提出分配色谱法 1944年，Martin等又提出纸色谱法 1952年，Martin和James发明了气液色谱法1955年，第一台商品气相色谱问世，标志着现代色谱分析的建立1956年，Stahl系统研究了薄层色谱法,1967年，Horvvath和Huber等研制了高效液相色谱仪1975年，Small等提出离子色谱 20世纪80年代，超临界色谱20世纪90年代，毛细管电泳（1809年Re

2、ss第一次电泳实验）21世纪，联用技术、大分子色谱分离、制备色谱取得很大的发展,1903年3月21日俄国植物学家茨维特（Michael Tswett，1872-1919）在华沙自然科学学会生物学会议上发表了“一种新型吸附现象及其在生化分析上的应用”研究论文，介绍了一种应用吸附原理分离植物色素的新方法，并首先认识到这种层析现象在分离分析方面有重大价值。1906年他在德国植物学杂志发表文章，首次命名上述分离后色带为色谱图，称此方法为色谱法（Chromatography）。1907年在德国生物学会年会上，展示过带有色带的分离柱管和纯化过的植物色素溶液。茨维特被世人公认为色谱创始人。,把菊根粉或白垩粉

3、（CaCO3）装在玻璃管中，将植物叶子的石油醚提取液倒入管中，然后加入石油醚淋洗。随着淋洗进行，样品中各种色素向下移动的速度不同，逐渐形成一圈圈的连续色带。茨维特在当时的实验中观察到6个色带，包括胡萝卜素、叶黄素和叶绿素A和B。,Chromatographic columnStationary phaseMobile phase or eluent,茨维特工作的主要贡献（采用吸附色谱）成功分离了叶绿素a和叶绿素b 提出/发明了色谱法1931年，Kuhn采用柱色谱分离了类胡萝卜素，进一步确定了-和-胡萝卜素的同分异构体，以及分别从植物叶片和蛋黄中分离得到叶黄素，才使色谱法引起科学界的重视。Kuh

4、n实验不仅证明了蛋黄叶黄素是氧化类胡萝卜素的混合物，而且证实了色谱法可以用来进行制备分离。,获得1952年度的诺贝尔化学奖Martin和Synge的主要工作：采用水分饱和的硅胶作固定相，以含有乙醇的氯仿作流动相，甲基橙作显色剂（指示氨基酸的位置）分离苯丙氨酸、亮氨酸、异-亮氨酸和脯氨酸-缬氨酸-蛋氨酸等三组氨基酸。首次提出分离过程的塔板理论，这是在色谱柱操作参数基础上模拟蒸馏理论，以理论塔板来表示分离效率，定量地描述、评价分离过程；,在色谱过程中最早引入分配平衡取代吸附平衡，即采用分配色谱进行分离。该方法是针对逆流液-液萃取难题而发明的。即将一种液体固定在适当的载体上，使第二种液体流过前者而实

5、现分离，这也是一个很重要的成就。提出了色谱法进一步发展最有远见的预言：一是“流动相可用气体来代替，对分离更有好处”；二是“使用非常细颗粒的填料和柱两端施加较大的压差，应能得到最小的理论塔板”。,Archer John Porter Martin,Richard Laurence Millington Synge,for their invention of partition chromatography,1952年，Martin和James发表第一篇气液色谱论文，首次用气体作流动相，配合微量酸碱滴定，发明了气相色谱，它给挥发性化合物的分离测定带来了划时代的革命。Van Deeter、Gidd

6、ings等人对色谱理论的研究极大地促使色谱技术的发展。1955年，第一台商品气相色谱问世，标志着现代色谱分析的建立。1957年,戈雷(Golay)发表“涂壁毛细管气液分配色谱理论和实践”论文，首先提出毛细管速率方程，并第一次实现了毛细管气相色谱分离。1979年,弹性石英毛细管应用于气相色谱,将毛细管气相色谱推上高潮。80年代将固定液固载化是毛细管色谱技术的又一个重要发展。它大大提高了色谱柱的稳定性,延长了柱寿命,并使液膜进一步增厚,提高了色谱性能(如可在高温下使用)。,Horvvath(1967)、Huber(1967)、Kirkland(1969)分别研制高效液相色谱仪，他们的主要贡献主要是

7、技术上的突破：高效填料：细颗粒、耐压；特别是键合固定相 高压泵:克服细填料带来的流速慢的缺点，加快了传质过程 仪器检测：高灵敏度连续检测 高效液相色谱的重要特征是由“开放柱液相色谱”向“密闭柱液相色谱”方向发展。1975年，Small,Stevens 和Baumen发表“Novel Ion Exchange Chromatographic Method Using Conductimetric Detection”一文，采用离子抑制柱-电导检测器检测，标志着离子色谱法的诞生。,色谱与色谱分析,色谱法是一种分离方法，它利用物质在两相中分配系数的微小差异，当两相作相对移动时，使被测物质在两相之间进

8、行反复多次分配，这样原来微小的分配差异产生了很大的效果，使各组分分离，以达到分离、分析及测定一些物理化学常数的目的。,分离性质差异：在两相间的分配差异多次反复分配：分离效果被扩大,分配系数是广义的，包括溶解、吸附、离子交换、亲和力和分子体积等分离特性。,物质能否分离取决于它们之间是否存在分配差异，这是一切分离的必要条件，色谱也不能例外。,与其它分离法相比，色谱法的高效率在于独特的“动态分离过程”，即反复多次分配，它大大扩大了原来分配系数的差异，从而实现混合物的分离。,由于色谱（包括电泳）分离的宏观特征之一是“差速迁移”，即样品同时进入色谱柱或在同一起始位置，经过“一定时空”的分离：,内色谱：固

9、定分离时间，各组分处在色谱或电泳分离通道上不同位置（如TLC的斑点位置）。,外色谱：固定分离路程，各组分以不同时间流出色谱柱或到达检测器（色谱图）。距离和时间的测定是简便的和准确的。,色谱分析法是一种十分重要和应用广泛的仪器分析方法。它采用色谱分离和连续测定方式相结合方式，实现了对复杂体系中的多组分（包括价态、性质相近的元素或化合物）分析。可见，色谱分析的关键是实现分离分析系统化/一体化。,现代色谱分析包括GC、HPLC、SFC、HPTLC、CE及联用技术。,色谱常用术语,1固定相 固定相是由层析基质组成的。其基质包括固体物质(如吸附剂、离子交换剂)和液体物质(如固定在纤维素或硅胶上的溶液)，

10、这些物质能与相关的化合物进行可逆性的吸附、溶解和交换作用。2流动相 在层析过程中推动固定相上的物质向一定方向移动的液体或气体称为流动相。在柱层析时，流动相又称洗脱剂或洗涤剂(即推动有效成分或杂质向一定方向移动的溶液)。在薄层层析时流动相又称展层剂。,3.色谱 以基质为固定相(柱状或薄层状)，以液体或气体为流动相，有效成分和杂质在这两个相中连续多次地进行分配、吸附或交换作用，最终结果是使混合物得到分离。,4.操作容量 即在特定条件下，某种成分与基质反应达到平衡时，存在于基质上的饱和容量。一般以每克(或毫升)基质结合某种成分的摩尔数或毫克数来表示。其数值大，表明基质对某种成分的结合力强。否则反之。

11、,5床体积(Vt)通常床体积是指膨胀后的基质在层析柱中所占有的体积(Vt)。Vt是基质的外水体积(Vo)和内水体积(Vi)以及自身体积(Vg)的总和。即 VtVo十Vi十Vg,6洗脱体积(Ve)洗脱体积是指某一成分从柱顶部到底部的洗脱液中出现浓度达到最大值时的流动相体积。7外水体积(Vo)外水体积指基质颗粒之间体积的总和。8内水体积(Vi)内水体积是指基质颗粒内部体积。,9.基质体积(Vg)基质体积是指基质自身所具有的体积。Vo、Vi、Vg都是随着床体积和基质性质变化而变化的。,图 层析床的外水体积(Vo)、内水体积(Vi)、总体积(Vt)示意图,10分配系数和迁移率 分配系数是指一组分在固定

12、相与流动相中含量的比值。常用K表示。迁移率是指一组分在相同时间内，在固定相移动的距离与流动相移动距离之比值，常用Rf表示。K值大，就表明该组分对固定相结合力大，迁移率小。反之则结合力小，迁移率大。不同物质的分配系数和迁移率是不一样的。几种物质之间的分配系数或迁移率的差异程度是决定它们采用层析方法能否分离开的先决条件。其差异程度越大分离效果就越好。,色谱设备,色谱柱 梯度混合器 恒流泵 部分收集器 检测仪 记录仪,色谱柱,梯度混合器,图溶液梯度的形成,盐浓度,盐浓度,盐浓度,流出液体积,流出液体积,流出液体积,型,型,型,恒流泵,自动部分收集器,紫外检测仪,记录仪,AKTA purifier 1

13、0,1.色谱柱2.吸附剂及用量3.装柱4.上样和洗脱5.收集和检测6.吸附剂的再生,色谱操作,图 理想的装柱示意图,4.上样和洗脱,图 加样操作示意图,5.收集和检测6.吸附剂的再生,色谱分类,按两相所处状态分：,按色谱原理分：,固定相 各组分对固定相,按操作形式分：,按色谱动力学过程分类 迎头法、顶替法和洗脱法 按应用目的分类 分析型色谱和制备型色谱 按色谱过程的特殊物理化学原理或特殊的操作方式分类，如：*化学键合相色谱*裂解色谱*二维色谱*手性色谱,其他分类方式,色谱图与色谱参数,色谱图（色谱流出曲线）是柱后流出物通过检测器产生的响应信号对时间或流动相流出体积的关系曲线图。它反映分离的各组

14、分从色谱柱洗出浓度随时间的变化，从一个侧面记录组分在柱内运行的情况。,分离过程研究或分离制备，关注被分离物在柱上的位置；“谱带，Band”分析测定关注分离信号；“色谱峰，Peak”,色谱峰的个数、位置、大小和形状？,l色谱峰个数：与样品组分数有关,l色谱峰大小：“定量”峰高和峰面积,l色谱峰形状：“高斯峰”，峰宽“柱效”：标准偏差、半峰高宽度、峰（底）宽 W0.607h=2 Wh/2=2.354 W=4,l色谱峰位置：“定性”保留时间或保留体积；死时间或死体积；计算容量因子等参数,保留值定性的依据：两个相同的物质在相同的色谱条件下应该有相同的保留值。但相反的结论不一定成立，即在相同的色谱条件下

15、，具有相同的保留值的两个物质不一定是同一物质。这就使得使用保留值定性时必须十分慎重。,实验方法：在相同的色谱条件(色谱柱、流动相组成、柱温、流速等不变)下分别测定被测化合物与标准样的保留值，如果保留值相等,就可初步认为被测化合物为标准样化合物。,利用保留值定性方法简便,除了要求提供标准化合物（对照品）、控制相同色谱条件外，更重要的是要对样品组分要有足够的了解,同时相关组分的分辨率要足够高。,由于某些组分的保留值可能相同或非常接近,可采用不同(特别是性质相差较大)的色谱体系,如多次改变流动相组成后,若被测化合物的保留值与标准物的保留值均保持一致,则能进一步证明被测化合物与标准物一致。其他色谱定性

16、方法。,如何提高保留值定性方法的可靠性？,色谱峰形状与峰宽,在等温线性的色谱条件下，色谱峰一般呈对称的正态分布（高斯，Gaussian）曲线。色谱流出曲线方程为：,3a）为什么大多数色谱图不是对称的高斯峰？3b）增大进样量，色谱峰增大，半高峰宽会变大吗？为什么？3c）峰宽与柱效的关系,色谱峰的区域宽度与组分的保留时间一般呈线性关系，即峰半高宽度或峰低宽度随组分保留时间呈线性增加。,影响色谱峰大小的因素,a）峰高可以定量吗？为什么？b)对于同一样品中的A和B两个组分，能否直接用峰大小判断它们的含量大小？,进样量:m=CV 检测器灵敏度，如波长选择、灯能量 流速 记录仪参数（纸速、灵敏度）,（1）

17、色谱定量分析的基本公式 与其他仪器分析一样，色谱定量分析是一种相对定量方法。任何色谱分析的定量基础是：Ai=fiCi0V0 或 hi=fiCi0V0 建立定量分析方法都必须验证A（h）m（C）的线性范围。,（2）定量校正因子的测定l同一种物质在不同类型检测器上有不同的响应灵敏度l同一种检测器对不同类型物质有不同的响应值,色谱图是色谱分析的主要技术资料。色谱图除了样品（化合物）名称，还应注明色谱柱（固定相）、流动相（载气）、操作条件（柱温等）、检测器的类型和操作参数，样品类型及有关说明等。,色谱图提供的分析信息l直观分离情况 l混合试样中的最低组分数 l柱效 l定性 l定量,色谱应用与局限,色谱

18、法与经典化学分析的比较 色谱法与光谱、质谱分析法的比较 色谱分析的特点 色谱分析的局限性：定性能力？（未知样品）色谱数据的“漂移”？（对比光谱数据）,色谱法与经典化学分析的比较 化学分析根据物质具有某种独特的化学性质来进行测定,而色谱分析能使许多化学性质相同/相似的复杂组分相互分离后测定。,色谱法与光谱、质谱分析法*的比较 光谱、质谱主要是定性分析工具,色谱是分离分析的工具。色谱法的最大优越性在于它最擅长分离分析多组分的复杂体系。,*从分离科学角度分析，色谱法、电泳法和质谱法有哪些异同点？,色谱法与分馏法的比较 色谱分离比分馏快，得到的物质纯度比分离法高。石油化学家采用分馏法花了20多年才鉴别

19、出石油中的200余种组分，而当今采用毛细管GC仅需数小时即可完成。,苯和环己烷的bp仅差0.6，如用分离柱进行分离是不可能的。（？）,图 苯和环己烷气相色谱图50cm0.5cm(id)，5%丁二酸乙二醇聚酯/Celite载体（100-120目），柱温90,色谱分析的特点,(1)高选择性 对于那些性质极为相似的组分,如同位素、同分异构体,采用高选择性固定相，使它们之间的分配系数产生足够大的差异,从而实现良好分离。（色谱的热力学性质）,(2)高柱效 在良好的操作条件下，色谱柱能使复杂或相似的多组分样品,在两相间进行多次的分配(103-106)而实现分离。,(3)高灵敏度：多种高灵敏检测器，痕量杂质

20、分析的有力工具。,(4)分析速度快：复杂多组分样品分析仅几-几十分钟(5)定量准确：分离检测一体化，仪器实现自动化、微机化，保证分析结果的准确性。(6)应用范围广(7)试样用量少,色谱分析的应用面广,但它不是万能的。这要求色谱分析者必须根据分析对象和要求选择色谱方法(色谱系统、检测器等)。,（2）试液是否处理得当，是色谱分析又一个关键因素。试液含有不溶物、强酸或强碱性等存在，不仅可能影响分析结果，而且损坏仪器部件。,学习色谱分析时，应注意如下几个问题：（1）色谱仪并不是色谱柱和检测器的简单堆积，柱外效应是决定峰展宽的另一重要因素，是决定整个色谱系统连接的合理性的依据。,（3）现有色谱资料大多讨

21、论分子量低于2000的小分子化合物的分析。特殊的分离问题，如球烯化合物、生物大分子等分离不能简单地套用小分子化合物的色谱方法。,（4）为了达到选择良好的分析条件,取得良好数据,要求色谱工作者应完全了解色谱法理论,从逻辑上探讨错误的原因(或理性分析谱图),并不断地积累有关的经验。,色谱分析的局限性,对分析对象的鉴定功能较差 单次分析周期可能较长？浓度检测灵敏度可能较低？仪器及费用也许较贵 实验影响因素较多，需要有较高的专业知识,第三章 吸附层析(absorption chromatography),第一节 吸附柱层析,吸附柱层析是以固体吸附剂为固定相，以有机溶剂或缓冲液为流动相构成柱状的一种层析

22、方法。常用的吸附剂：极性 羟基磷灰石、硅胶、氧化铝、人造沸石等 非极性 活性炭等。,一、基本原理,吸附剂的表面存在着许多随机分布的吸附位点。这些位点通过范德华力和静电引力与蛋白质和核酸等生物分子结合，其结合力的大小与各种生物分子的结构和吸附剂的性质有密切关系。,图 吸附柱层析原理示意图1.吸附层析柱 2.加入A、B混合样品 3.洗脱时，A与B开始分离 4.继续洗脱时，A与B已经分离,二、吸附剂,1吸附剂的选择 吸附剂应具备性能：表面积大、颗粒均匀、吸附选择性好、稳定性强和成本低廉等。,2.吸附剂的性质 羟基磷灰石(HA)硅胶,三、洗脱剂,合适的洗脱剂应符合下列条件：纯度较高 稳定性好 能较完全

23、洗脱下所分离的成分 粘度小 易和所需要的成分分开。,1.纯化生命物质,四、应用,图 天然的双链(ds)和热变性单链(ss)小牛胸腺DNA在HTP层析柱的分离图谱,2.分离蛋白质的亚基,一般蛋白质经SDS或Triton X100等去污剂处理后，会产生分子量不同的蛋白质亚基。这些物质可通过吸附柱层析方法得到分离(见图)。,图 14C-组氨酸标记的免球蛋白亚基在HA层析柱的分离图谱,第二节 薄层层析Thin layer chromatography,TLC,薄层层析(thin layer chromatography,TLC)是以涂布于玻板或涤纶片等载体上的基质为固定相，以液体为流动相的一种层析方法

24、。其基本原理和柱层祈、纸层折比较相近。这种层析方法是把吸附剂等物质涂布于载体上形成薄层，然后按纸层析操作进行展层。,分类,吸附薄层层析(吸附剂为固定相)分配薄层层析(固定在支持剂上的水溶液或有机溶剂为固定相)离子交换薄层层析(离子交换剂为固定相)等,表 薄层层析常用的基质,与纸层析比薄层层析多一步薄层板的制作：将支持剂均匀地涂布在玻璃板上而成薄层板。所用玻璃板要求表面平整、光滑，用前应洗净、干燥。薄层板常用的制作方法有：1、浸涂法：将玻璃板在调好的支持剂浆液中浸一下，使浆液在玻璃板上形成薄层。2、喷涂法：用喷雾器将调好的浆液喷在玻璃板上，形成薄层。3、倾斜涂布法（倾淌法）：将调好的支持剂浆液倒在玻璃板上，然后将玻璃板前后左右倾斜，使支持剂漫布于整块玻璃板上而形成薄层。,4、推铺法：在一根玻璃棒的两端适当距离处分别绕几圈胶布条，胶布条的圈数视所需薄层层析厚度而定，然后把准备好的支持剂倒在玻璃板上的一端，用玻璃棒压在玻璃板上，将支持剂均匀地向另一个方向推动，而成为一薄层。,薄层层析的其它操作方法与纸层析类似：点样、展开、显色、定性与定量分析。,