第3章基因工程制药技术.ppt

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1、重组DNA技术是在分子水平对基因进行体外操作，因而也称为分子克隆(molecular cloning)或基因克隆。所谓克隆(clone)：是指通过无性繁殖过程所产生的与亲代完全相同的子代群体。,分子克隆：是在体外对DNA分子按照既定的目的和方案进行人工重组，将重组分子导入到合适的受体细胞中，使其在细胞中扩增和繁殖，以获得DNA分子大量复制，并使受体细胞获得新得遗传特征的过程,基因工程：利用分子克隆技术来操作目的基因，并改变生物的遗传性状的过程就称为基因工程。,基因工程最基本的必备的材料：工具酶 载体目的基因原核或真核宿主细胞,分子克隆的基本过程:分：得到目的基因切：将目的基因和载体用适当的限制

2、性内切酶切割接：将目的基因和载体连接，形成重组子转：将重组子转到适当的宿主细胞中筛：筛选出含正确重组子的宿主细胞，扩增,第一节 基因工程中常用工具酶,工具酶分类使核酸降解的核酸酶类：核酸内切酶、核酸外切酶催化核酸合成的酶类：DNA聚合酶，RNA聚合酶，连接酶，逆转录酶核酸修饰酶类：甲基化酶，激酶，基团转移酶，磷酸酶等,一、限制性核酸内切酶,概念的提出及背景：30年代初，微生物学家发现，微生物的噬菌体不能交叉感染（“细菌免疫”）。限制现象（限制性内切酶）修饰现象（甲基化酶）,1962年W.Arber提出；菌体中含有2种以上功能不同的酶：核酸内切酶（限制）DNA甲基化酶（修饰）,限制性核酸内切酶(

3、restriction endonuclease，RE)是由细菌自己产生的一种能识别双链DNA中的特定序列，并以内切方式水解核酸中磷酸二酯键的核酸内切酶。,1限制性核酸内切酶的分类：,I型RE：由三种不同的亚基组成。需Mg+，S-腺苷甲硫氨酸（SAM），ATP为辅助因子；识别位点复杂，特异性差。通常在识别位点的4007000bp范围内切割DNA。现已报道19种。,型RE；由两种亚基组成。需Mg+，ATP为辅助因子；切割位点靠近识别序列但较难预测。一般在2527bp范围内切割。现已报道4种。I、型RE酶同时具有限制(剪切)与修饰(甲基化)两种功能并依赖于ATP，切割DNA链的位置远离识别序列，因

4、此I型和型酶在DNA重组技术中都不常用。,型RE实际应用价值最大，这是因为：型酶只具有限制性活性，无甲基化修饰活性；对DNA的切割要求严格的序列作为靶位点，切割精确；此类酶作用时只需Mg2+参与，无需ATP。因此型限制性核酸内切酶是基因工程中剪切DNA分子的常用工具酶，被誉为“分子生物学家的手术刀”。,2限制性内切酶的命名 目前已广泛采用Smith和Nathams于1973年提出的命名系统：限制性内切酶第1个大写字母：来自细菌的属名(genus)，第2、3个小写字母：来自种名(species)，第四个字母代表菌株(strain),3型限制性内切酶的作用特点：被分子生物学家广泛研究应用，现已发现

5、有200多种识别序列的REMW=60KD的单链多肽最适pH：68NaCl有抑制作用，Mg2+激活，巯基有保护作用热不稳定。,作用特点：有严格的识别、切割的DNA序列，并以内切的方式水解双链DNA中的磷酸二酯键。识别序列一般为46个碱基对。切割靶序列的大小决定了切割DNA链后产生的DNA片段的长短切割后产生平头或粘性末端。只需Mg2+，不需ATP。,4.型酶切割dsDNA可产生两种不同的切口1.平头末端(blunt end)即在识别序列的对称轴上进行切割；2.粘性末端(cohesive end)即在识别序列的两个对称点切开DNA双链，产生末端带有单链尾巴的切口。根据突出端不同分为：5粘性末端和3

6、粘性末端。,型酶切割dsDNA产生的两种不同的切口,5.三类特殊性质的型限制性内切酶：同裂酶(isoschizomer)：又称源同异工酶，即识别位点相同，但切割位点可以相同，也可以不同，例如Sam I(CCCGGG)和Xma I(CCCGGG),Sau3A I BamH I GATCGGATCC CTAG CCTAGG SauI Xho I GTCGACCTCGAG CAGCTGGAGCTC,同尾酶(isocaudarmer)：不同来源的酶其识别和切割序列有一定的相关性，作用后能产生相同的粘性末端。,可变酶：此种酶所识别DNA序列中的一个或几个碱基是可变的，并且识别序列往往超过6个碱基对，例如

7、Bstp I识别序列为：GGTNACC，其中N为一可变碱基。,6.RE识别序列呈反向对称，分为四种类型,回文结构：（Palindrome）如：EcoRI：5，GAATTC3，3，CTTAAG5，间断回文结构（interrupted Palindrome）如：BgI：5，GCCNNNNNGGC3，3，CGGNNNNNCCG5,简并序列（degenerate sequence）又称“松弛”特异识别，即识别位点中某些核苷酸可以被其他核苷酸替换。如：5335 非回文结构：如：5 33 5,7限制性内切酶的应用,限制性内切酶除作为基因工程中剪切DNA的工具外，还广泛应用于分子生物学研究的各个领域内。,绘

8、制物理图谱及基因同源性比较DNA测序及基因组分析基因突变与遗传性疾病的诊断等改造及重组质粒DNA克隆及亚克隆的建立,8.RE使用时的注意事项,要求较纯的底物DNAMg2+和Tris-HCl缓冲体系，pH7.2-7.6反应体系中不能含有酚、氯仿、乙醚、SDS以及大于10mmolL的EDTA适合的离子强度二硫苏糖醇或-巯基乙醇低温或冰浴,二、DNA聚合酶 DNA polymerase,分子克隆常用的DNA聚合酶：依赖DNA的大肠杆菌DNA聚合酶IKlenow大片段T4噬菌体DNA聚合酶Teq DNA聚合酶T7噬菌体DNA聚合酶经修饰的T7噬菌体DNA聚合酶（测序酶）耐热DNA聚合酶依赖RNA 的D

9、NA聚合酶（逆转录酶）,1DNA聚合酶I：,DNA聚合酶I是Kornberg从大肠杆菌中发现的第一个DNA聚合酶。此酶是一个多功能酶，包括3种酶活性：5-3聚合酶活性：催化单核苷酸聚合到DNA的3-OH末端，使DNA链从5-3延伸；5-3外切酶活性：即从游离的5末端降解双链DNA或单链DNA成为单核苷酸 3-5外切酶活性。另外该酶还具有RNA酶H活性（降解DNA-RNA杂合体中的RNA）。,DNA聚合酶I作用条件：,全部4种dNTP(dATP、dTTP、dCTP、dGTP)、Mg2+DNA作为模板，单链DNA或有缺口的双链DNA均可；需要具有游离3-OH的引物或缺口的3末端,DNA聚合酶I的应

10、用：,催化DNA切刻平移(nick translation)反应，制备高比活性DNA探针 第二条cDNA链的合成；对DNA 3凸出末端进行末端标记；DNA序列分析,2Klenow片段,C末端大片段Klenow片段（70KD）含5-3聚合酶活性和3-5外切酶活性（保证了DNA复制的精确性）枯草杆菌 蛋白水解酶 DNA聚合酶I N末端小片段 含5-3外切酶活性,Klenow片段功能：,双脱氧法序列分析随机引物标记核酸探针cDNA第二链合成对5凸出粘端补平或对双链DNA 3端标记PCR技术：PCR技术是根据Klenow酶的5-3聚合活性而设计诞生的,3T4噬菌体DNA聚合酶,从T4噬菌体感染E.co

11、li中获得。MW=114KD 单链多肽。活性与Klenow片段相似：5-3聚合活性；3-5外切活性。特点：1.外切活性=Klenow片段外切200倍2.外切活性的强度：单链底物大于双链底物,应用：,补平或标记5凸出粘端。对DNA 3凸出粘端进行末端标记。用3-5外切活性切除3凸出粘端，甚至形成5凸出粘端，再用高浓度dNTP标记掺入，利用5-3聚合活性获得标记物。通过取代反应，标记核酸探针。,5 33 5 T4 DNA pol 35外切活性 5 3 3 5 T4 DNA pol 32PdNTP 5 3 3 5 E CoRI，BamHI RE消化 5 35 3 3 53 5 凝胶电泳提取纯化特异探

12、针,T4DNA聚合酶的应用（标记探针）,4.Taq DNA聚合酶,Taq DNA聚合酶是一种依赖DNA的单亚基耐热DNA聚合酶，分子量约为65kD。该酶最初由极端嗜热水生菌Thermus aquaticus中提取并纯化，目前已能通过基因工程方式大量生产。,Taq DNA聚合酶的应用,Taq DNA聚合酶主要用于PCR中。最适温度在7075，随着温度的降低，酶活性明显下降。同时此酶缺乏3-5外切酶活性，因而无校正功能。,Taq DNA聚合酶的应用条件,需Mg2+（1mmol/L）。低浓度Mn2+（2mmol/L）有低活性。Ca2+使其完全失活。一价阳离子高至0.1mol/L对其活性无影响。最适浓

13、度：NaCl=40mmoL/L KCl=60mmol/L最适pH：7.8 Tris-HCl buff,三、DNA连接酶：,催化双链DNA中相邻碱基的5磷酸和3羟基间磷酸二酯键形成的酶，称为DNA连接酶(DNA ligase)。DNA连接酶主要有两种：T4噬菌体DNA连接酶大肠杆菌DNA连接酶,1T4噬菌体DNA连接酶,T4 DNA连接酶最早是从T4噬菌体感染的大肠杆菌中发现并分离的，分子量68kDa。,主要功能及用途：连接双链DNA中一条链上的切口连接互补粘性末端的DNA片段（连接反应通常在1215下进行）DNA分子间的平头末端（平端的连接通常在室温下进行）,2大肠杆菌DNA连接酶,特点：连接

14、双链DNA中一条链上的切口 间存在的互补粘性末端的DNA片段需NAD+连接平头末端DNA分子需聚乙二醇或Ficoll、情况下可代替T4DNA连接酶，它产生的背景低，准确性高。,大肠杆菌DNA连接酶功能,可修复dsDNA中的单链切口，并可催化互补黏性末端的连接，主要用于cDNA第二链的合成。能促进平端连接，但效率仍很低；在非平端连接时可代替T4DNA连接酶，它产生的背景低，准确性高。,四、反转录酶：,能以RNA为模板合成DNA的DNA聚合酶称为反转录酶(reverse transcriptase，RT)，合成的DNA产物称为互补DNA(complementary DNA，cDNA)。常用的逆转录

15、酶有禽类成骨细胞性白血病病毒(AMV)逆转录酶和Moloney小鼠白血病病毒(Mo-MLV)逆转录酶,反转录酶的作用特点：,以单链RNA或单链DNA为模板合成DNA，可用于cDNA第一链和第二链的合成有5-3和3-5RNA外切酶活性，3-5RNA外切酶活性可用于降解RNA-DNA杂交分子中RNA缺乏3-5DNA核酸外切酶活性,反转录酶的应用：,cDNA的合成补平和标记DNA的3 末端代替Klenow片段杂交探针的制备,五、末端转移酶,末端脱氧核苷酸转移酶(terminal deosynucleotidyl transferase，TdT)多从小牛胸腺中分离出，能催化多个脱氧核苷酸依次加到DNA

16、 3末端。,末端脱氧核苷酸转移酶的作用特点：,此酶活性尤以带3突出的DNA作为受体为佳在含有Mg2+、Co2+和Mn2+的低离子强度缓冲液中此酶也能作用于3平端或5凹端的DNA分子，若加入嘧啶核苷酸，则以Co2+为首选阳离子；若加入嘌呤核苷酸，则以Mg2+离子为首选阳离子。,末端脱氧核苷酸转移酶的作用：末端转移酶常用于给载体或cDNA加上互补的多聚尾巴，构建人工粘性末端；也用于DNA分子3端标记。,六、碱性磷酸酶：,碱性磷酸酶(alkalinephosphatase)来源于大肠杆菌和牛小肠，能水解DNA、RNA以及脱氧核糖三磷酸(dNTP)上的5磷酸根。,碱性磷酸酶应用：,在分子克隆的连接反应

17、中预先处理载体DNA片段，以去除5-P，防止载体重新自体连接，以提高重组效率；用32P标记5末端时，用此酶去除5-P，再用激酶对5末端进行同位素标记；作为化学发光物测定或其他检测系统的指示酶。,七、依赖于DNA的RNA聚合酶,常用的有噬菌体SP6、T7、T3 RNA聚合酶，其中SP6 RNA聚合酶来源于SP6噬菌体感染的鼠伤寒沙门菌(Salmonella typhimurium)，T7、T3 RNA聚合酶源自大肠杆菌，目前这些RNA聚合酶已能用基因工程的方法大量制备。,依赖于DNA的RNA聚合酶功能,可以识别双链DNA模板上相应的噬菌体特异性启动子，起始RNA的合成可用于合成单链RNA以作为杂

18、交用探针、体外翻译系统中的功能性mRNA，体外剪接反应的底物；也可以直接用于原核或真核细胞中克隆基因的表达。,第二节 基因克隆常用载体,所谓载体(vecter)是指能在连接酶作用下和外源DNA片段或基因连接，并运送DNA分子进入受体细胞的DNA分子。目前用于基因克隆的载体种类繁多，包括在大肠杆菌中使用的质粒、噬菌体载体、酵母菌质粒载体以及动、植物病毒载体等,载体的发展概况 第一阶段（1977年前）：天然质粒和重组质粒的利用，如pSC101,colE1,pCR,pBR313和pBR322 第二阶段：增大载体容量(降低载体长度)，建立多克隆位点区和新的遗传标记基因。如pUC系列载体第三阶段：进一步

19、完善载体功能以满足基因工程克隆中的不同要求，如M13系列载体，含T3，T7，sp6启动子载体，表达载体及各种探针载体,载体必须具备以下基本条件：,能自我复制具备多种限制性内切酶的识别位点：多克隆位点(multiple clone site,MCS)具有多个利于选择和筛选标记有足够的容量，具有拷贝数高、易与宿主细胞的DNA分子分离并易提取、抗剪切力强。表达型载体还应具备与宿主细胞相适应调控元件,标记基因的种类 1）抗性标记基因（可直接用于选择转化子）a.抗生素抗性基因:Apr，Tcr，Cmr，Kanr，G418r，Hygr，Neor b.重金属抗性基因:Cur，Znr，Cd r c.代谢抗性基因

20、:TK，抗除草剂基因 2）营养标记基因（可直接用于选择转化子）主要是参与氨基酸、核苷酸及其他必需营养物合成酶类的基因，这类基因在酵母转化中使用最频繁，如TRP1，URA3，LEU2，HIS4等。3）生化标记基因 其表达产物可催化某些易检测的生化反应，如lacZ,GUS,CAT,常用的遗传标记基因 1)氨苄青霉素抗性基因（Apr）Ampicillin可抑制细菌细胞膜上参与细胞壁合 成酶类的活性。Apr抗性基因编码一种分泌到细 菌细胞周间质的酶，催化内酰胺环的水解，使氨苄青霉素失活。2)四环素抗性基因（Tcr）Tetracycline 可结合在核糖体30s亚基中的一种蛋白质分子上，抑制核糖体的转位

21、过程。四环素抗性基因编码一种399 AAs蛋白质，与细菌细胞膜结合，阻止四环素分子进入细菌细胞。,遗传选择标记：,氨苄青霉素抗性(ampicillin resistance，ampr)基因：Ampicillin可抑制细菌细胞壁的合成。Ampr基因编码内酰胺酶，催化-内酰胺环的水解，使氨苄青霉素失活而使细菌产生耐药。,四环素抗性(tetracycline resistance，tetr)基因：Tetracycline 可结合在核糖体30s亚基中的一种蛋白质分子上，抑制核糖体的转位过程。Tetr基因编码一种膜相关蛋白，与细菌细胞膜结合以阻止四环素进入细胞。,氯霉素抗性基因（Cmr）Chloroph

22、enicol可结合在核糖体50 S亚基上，阻止蛋白质合成。Cmr基因编码氯霉素乙酰转移酶，使氯霉素乙酰化，导致乙酰化的氯霉素不能结合在核糖体上。卡那霉素(Kanr),新霉素(Neor)和G418抗性(G418r)基因 Kanamycin，Neomycin和G418均属脱氧链霉胺氨基葡萄糖苷类抗生素，可结合在核糖体上阻止蛋白质的合成。来自转座子Tn5和Tn903的Kanr抗性基因均可使这类抗生素磷酸化，使之不能进入细胞内。,不同的质粒具有不同的抗药基因，质粒的Ampr、Tetr基因若被外源基因插入而失活，就失去了耐药性，因此抗药基因常作为基因工程的筛选标志。,Ampicillin resista

23、nt?yes yesTetracycline resistant?No yes,B X B,B,B,X,Ampr,ori,Ampr,Tcr,ori,Screening by insertional inactivation of a resistance gene,back,Replica plating:transfer of the colonies from one plate to another using absorbent pad or Velvet(绒布).,transfer of colonies,+ampicillin,+ampicillin+tetracycline,th

24、ese colonies have bacteria with recombinant plasmid,大肠杆菌Lac Z基因：Lac Z基因编码半乳糖苷酶。用含有X-gal的培养基培养细菌时，在细菌的乳糖操纵子(Lac operon)诱导物异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)的作用下，细菌合成半乳糖苷酶，分解X-gal，菌落变为蓝色；如果Lac Z基因被外源DNA分子插入而遭到破坏，则不能生成相应的半乳糖苷酶，菌落为白色。通过观察菌落的颜色，能方便地进行基因克隆的筛选工作。,-半乳糖苷酶基因有1021 AAs，基因产物不具酶活性，装配为四聚体后才有酶活。该蛋白质可分为两部分：链和链。前者负责四聚体

25、装配，后者具-半乳糖苷酶活性；只有当两者都存在时，才会表现出酶活性，该作用称之为-互补作用。链编码的基因称之为lac Z(编码145 AAs)-半乳糖苷酶基因的优点:a.酶催化X-Gal水解为蓝色产物，检测直观 b.lac Z 编码5-端可容许很大的变化而不影响酶活性 c.lac Z 和链基因的分别表达可使载体小而容量大,LacZ基因的结构与产物,1质粒载体：,质粒(plasmid)是细菌染色体外的遗传单位，自身含有复制起始点，与相应的顺式调控元件组成一个复制子(replicon)，能利用细菌的酶系统进行独立的复制及转录。,用于基因克隆的质粒载体具有以下特点：,分子较小，比较稳定，拷贝数高。含

26、有高效的复制子，能在细菌的蛋白质合成受阻，染色质DNA合成停止时，利用细菌的酶系统进行质粒自身的复制。因此在实验中常利用氯霉素以阻止细菌蛋白质的合成，而使质粒的拷贝数增加至数千。具有多种遗传选择标记，包括各种抗药基因或营养代谢基因等。,pBR322：,pBR322是研究得最清楚应用也最广泛的质粒，全长4363bp，由3种野生质粒成分构建而成，含有Ampr和Tetr两个抗药基因标记，一个复制起始点(ori)，复制子为Col EI。其中ori来自pM9，Ampr来自pRSF2124，Tetr来自pSC101。在Ampr和Tetr基因中共含有8个限制性酶切位点，以供外源DNA片段的插入。其中在Amp

27、r 基因中的单一酶切位点有Pst、Pvu等；在Tetr 基因中的位点有BamH、Hind、Sal等。,pUC18pUC19,pUC系列质粒是由大肠杆菌pBR质粒和M13噬菌体改建而成的质粒载体。全长2674bp，具有氨苄青霉素抗性基因，一个复制起始点，复制子为Col EI。pUC系列质粒带有一段大肠杆菌Lac操纵子DNA片段，能编码-半乳糖苷酶氨基端的一部分，同时与大肠杆菌的gal-基因互补。,当pUC质粒转化到gal-的宿主菌后，在含有诱导物IPTG和生色底物X-gal的培养基上形成蓝色菌落；如果外源DNA片段克隆到pUC的LacZ基因区域时，造成LacZ基因失活，在含有IPTG、X-gal

28、的培养基上将生成白色菌落。,Recreated vector:blue transformantsRecombinant plasmid containing inserted DNA:white transformants,Recreated vector(no insert),Recombinant plasmid(contain insert),2噬菌体,噬菌体的基因组DNA长度约为50kb，基因组比较复杂，共含有66个基因。从噬菌体颗粒中分离出的DNA分子为双链线状，当感染细胞后，噬菌体连接形成双链环状结构，并按造方式和滚环方式复制。噬菌体感染细菌后可进行裂解性生长和溶源性生长。,噬菌

29、体作为载体具有两个特点：,噬菌体生长繁殖所必需的序列位于其左右二臂上，噬菌体基因组中央含有约30的DNA是噬菌体生长所非必需的。噬菌体的成熟需要经过包装，当与外源DNA片段重组后的大小介于原来的78一105之间时，重组的DNA分子才可包装为成熟的噬菌体颗粒。,噬菌体载体类型：,置换型载体(replacement vectors)：允许外源DNA片段代替自身的生长非必需区，这种克隆方式容纳的外源DNA片段可达30kb。插入型载体(insertion vectors)：允许克隆的外源DNA片段较小，一般为7kb以下。,目前已构建了大量的噬菌体载体，例如Charon系列、gt系列、EMBL系列等各种

30、类型的载体。,gt：长43700bp，改造后含有Lac Z片段，克隆位点是EcoR，位于Lac Z的羧基端，插入的外源片段可达7kb。重组的gt因Lac Z基因的失活，在X-gal培养基中形成白斑，而未重组的gt形成蓝斑。,3.病毒载体：,在目前广泛使用的各种真核病毒载体中均含有各种相似的调控序列，包括DNA在真核细胞中的复制起始点、启动子、剪切位点、多聚腺苷化信号、增强子等。,反转录病毒载体(retrovial vector),反转录病毒(retrovirus)是一种RNA病毒，基因组全长810kb，该RNA有mRNA的功能，其5端是甲基化帽子结构，3端是polyA尾巴。,反转录病毒一般含有

31、3个基因：结构蛋白基因(gag)、反转录酶基因(pol)、糖蛋白基因(env)。许多反转录病毒还含有一个癌基因(onc)能使感染细胞发生转化。在反转录病毒基因组的两端分别有一个长末端重复序列(long terminal repeat，LTR)，其中含有启动子、增强子、整合信号及多聚腺苷化信号等调控序列。,反转录病毒改造为载体：,用标记基因和外源基因替代病毒的编码基因制备辅助细胞为载体DNA提供其丧失的功能将载体DNA导入辅助细胞以产生有感染力的病毒载体病毒载体感染靶细胞，外源基因在细胞内得以表达,反转录病毒载体：,通过基因工程改造，使病毒载体成为只有一次感染能力的重组RV载体。,反转录病毒载体

32、的优点：,具有穿透细胞的能力，可使近100的受体细胞被感染，转化细胞效率高；能感染广谱动物物种和细胞类型而无严格的组织特异性；随机整合的病毒可长期存留，且单拷贝、单位点，很少发生重排；容量大，可包装10kB外源基因,反转录病毒载体缺点：,这种载体只能把其DNA整合到能旺盛分裂细胞的染色体，而不适合于那些不能正常分裂的细胞，如神经元。最严重的问题是由于病毒自身含有病毒蛋白及癌基因，就有使宿主细胞感染病毒和致癌的危险性。操作较复杂,操作过程：,目的基因+有缺陷的反转录病毒重组DNA装入质粒导入辅助细胞分泌有感染力的病毒颗粒感染宿主细胞培养23天筛选,卸甲载体(disarmed vector):以用

33、完整的反转录病毒双链DNA为载体，将外源DNA片段取代反转录病毒中的癌基因，这样的载体就称为卸甲载体。,目前已构建的反转录病毒载体有两种,穿梭载体(shuttle vector):是一种既能在原核细胞又能在真核细胞中复制和表达的载体，由反转录病毒的LTR、包装信号和质粒的复制起始点、筛选元件等成分重组而成。由于此类载体缺乏反转录病毒的结构基因，需要野生病毒提供结构蛋白，以形成有感染力的重组体。目前此类载体已成为表达外源基因的重要基因工程载体。,1.用反转录病毒作为载体需要相应的包装细胞，以形成完整的体系。2.包装细胞提供结构蛋白，与带有外源基因的重组反转录病毒载体分子一起生成能高效感染靶细胞的

34、病毒颗粒。,反转录病毒载体的作用条件：,目前常用的反转录病毒载体有多种，例如经Moloney小鼠白血病病毒(Mo-MLV)改造构建成的载体，其宿主广泛，传染率极高，是目前最常用的反转录病毒载体。包装细胞也有多种，均由稳定的小鼠成纤维细胞系或QT6鹌鹑细胞系衍生而来，如第一代的-2、-am；第二代的PA3l7；新一代的CRIP，原则上包装细胞应避免产生具有复制力的野生型病毒。,SV40(Simian virus 40)(猴肾病毒)载体,SV40是一种小型球状病毒，其基因组为共价闭合环状双链DNA，长5243bp，编码5种蛋白质。SV40病毒颗粒可直接作为克隆载体使用，外源DNA以置换的方式取代S

35、V40的晚期区和早期区形成重组体。,直接用作克隆载体时存在许多缺点，因此目前已对其进行了相应的改造，衍生出一系列的SV40载体，能在多种哺乳动物细胞中表达，对基因组DNA和cDNA均能表达，对插入的外源基因大小无限制。目前常用的SV40衍生载体有pSVT7、pMT2等，它们都可进行外源基因的瞬时表达，广泛用于基因表达研究的各个领域。,昆虫病毒载体：,目前最常用的昆虫病毒载体是杆状病毒载体系统。杆状病毒(baculo virus)是一种大型、有包被的双链DNA病毒，主要感染节肢动物。,杆状病毒载体的特点：是真核表达系统，可直接进行蛋白修饰加工；重组区是病毒生长非必需区，基因组较大，可插入的外源D

36、NA片段较大；含有一个强包含体蛋白启动子不感染脊椎动物，比较安全；,4.酵母人工染色体载体：,酵母人工染色体(yeast artificial chromosome，YAC)载体可克隆和分离的DNA片段达l000kb。由于YAC系统作为载体其容量大，故能保持克隆基因的完整性，而且利用YAC构建人类的基因组文库，只需数千个重组体即可满足需要。,YAC的调控元件：(1)着丝粒(centromere)，以保证染色体在分裂过程中能正确分配到子代细胞。(2)端粒(telomere)，作为染色体复制所必需的成分，能防止染色体被核酸外切酶降解，(3)复制起始点、限制性酶切位点和筛选标记。(4)原核序列及调控

37、元件，包括大肠杆菌复制起始点、Ampr基因等，以利于在大肠杆菌中操作。,重组DNA技术的基本过程,第三节 目的基因的分离与制备第四节 目的基因的体外重组第五节 重组子导人宿主细胞第六节 阳性重组子的筛选和鉴定,第三节 目的基因的分离与制备,一、通过基因组文库分离、筛选基因二、cDNA文库分离、筛选基因三、人工合成基因四、应用聚合酶链反应获取目的基因五、高通量获取目的基因,一、通过基因组文库分离、筛选基因,基因组文库(genomic library)是指用基因克隆的方法保存在适当宿主中的DNA重组分子的集合，所有重组子所含的插入片段的总和代表某种生物基因组全部核酸序列。基因组文库的构建是将细胞中

38、的基因组DNA切割成一定大小的片段，与合适的载体(噬菌体、质粒、YAC系统等)进行重组，并转化宿主细胞。,在进行任一基因筛选时达到99以上的概率，这种方法类似于霰弹打鸟，因此也称为鸟枪法。要从如此庞大的文库中筛选出某一特定基因十分困难，尤其是单拷贝基因。随着分子生物学技术的发展，如分子杂交及探针技术的应用等，从基因组文库中筛选出特定基因已无大的困难。,二、cDNA文库分离、筛选基因,cDNA文库(cDNA library)是指利用基因克隆的方法保存在宿主细胞中的DNA重组体的群体，每一重组子只含一种mRNA信息，这些重组子的总和包含某种生物的全部mRNA序列。,cDNA文库是以mRNA为模板在

39、逆转录酶的作用下合成cDNA，经双链化后与合适的载体重组并导入宿主细胞而形成的。cDNA文库中的插入片段是由mRNA逆转录生成，可直接指导转录和翻译。亦即针对不同的组织或细胞所建立的cDNA文库代表各自特定的mRNA表达谱。,基因组DNA文库,cDNA文库,三、人工合成基因：,知道目的基因的结构与核苷酸序列及其他相关的基因信息。对于短片段(2030bp)的合成效率较高，对于较长的基因片段的合成，必须先按照已知的DNA序列将其划分为较短的片段，由合成仪逐一合成，再拼接成大片段。,四、应用PCR获取目的基因,选择不同的DNA分子为模板，通过PCR扩增以获取包括外显子、内含子以及相应调控元件的完整基

40、因片段；还可以用RNA分子为模板，通过逆转录PCR扩增生成cDNA以获得大量的不含内含子及调控序列，只含有结构基因的DNA片段。通过PCR技术获取的DNA片段可直接用于后续的基因克隆、探针制备、cDNA文库的建立等众多的分子生物学研究中。,五、高通量获取目的基因,系统生物学、组学(Omics)、高通量消减杂交技术：抑制性消减杂交(SSH)等基因芯片分析技术,第四节 目的基因的体外重组,DNA分子的体外重组:是DNA分子之间的连接过程。这是一个DNA连接酶催化的生物化学反应。,几种常用的DNA分子连接方法,粘性末端连接法(cohesive end ligation)平头末端连接法(blunt e

41、nd ligation)人工接头法(artifical linker)同源多聚尾序(homopolymeric tails)连接法,1粘性末端连接法(cohesive end ligation),这种方法适用于插入片段和载体分子具有相同的粘性末端(cohesive end)，相同的粘性末端在DNA连接酶的作用下很容易重新连接在一起。,II类限制酶一般识别长度为4个或6个呈二重对称的核苷酸特异序列,粘性末端连接法存在以下几点缺陷：,高背景 即存在一定数量的载体自身环化分子 双向插入 可采用定向克隆方式，即对载体和插入片段均使用两种内切酶进行处理。多拷贝插入 将造成表达困难。适当调整插入片段与载体

42、分子的比例能减少多拷贝插入的产生，一般采用2:1(插入片段摩尔数:载体摩尔数),2平头末端连接法(blunt end ligation),平头结构，在T4DNA连接酶的作用下同样能进行连接。但是这种连接方式的效率较低。这时应适当增加酶量，提高反应中底物的浓度并延长反应时间。,3人工接头法(artifical linker),人工接头主要用于在DNA分子的平头末端上添加新的内切酶位点以产生粘性末端，以提高连接效率。人工接头大小一般为812个碱基对。,4同源多聚尾序(homopolymeric tails)连接法,末端转移酶（TdT）能催化脱氧核苷酸逐个添加到单、双链DNA分子的3-OH末端上。目

43、的DNA分子与载体分子可通过多聚尾巴的同源互补连接在一起。末端转移酶的最适底物是具有3端突出的双链DNA。,同源多聚尾序连接法要求DNA分子内部必须完整，即两个DNA链间不存在缺口；否则末端转移酶也会在3-OH上加入多聚尾巴，破坏了DNA分子活性。由于在重组分子中加入了新的核苷酸序列，从而影响了DNA片段表达的真实性，而且外源DNA片段一般难以从载体上完整切下并回收。,定向克隆：,定向克隆是指将外源DNA片段定向插入到载体中的方法。要做到定向插入则要求载体DNA分子的两端不能互补，同时外源DNA分子的末端是不相互补的粘性末端，或者一端为粘性末端，另一端为平头末端。,第五节 重组子导入宿主细胞,

44、体外重组生成的重组子必须导入到合适的宿主细胞中才能进行复制、扩增和表达。宿主细胞分为两种：原核细胞和真核细胞。,质粒DNA分子或以质粒为载体构建的重组DNA分子导入细菌的过程称为转化(transformation)。通过噬菌体的释放和感染将DNA从一个细胞转移到另一个细胞的过程称为转导(transduction)。转染：是由转化和感染两个词构成的新词，指真核细胞主动或被动导入外源DNA的过程。,宿主细胞 重组载体转化 原核细胞 质粒感染（转导）原核细胞 噬菌体转染 真核细胞 质粒、病毒,感受态细菌(competent cell):系指利用理化的方法人工诱导细菌，使之处于易于吸收和容纳外源DNA

45、分子的状态，这时的细菌就称为感受态细菌。,一、转 化,（一）感受态细菌的制备：用冰预冷的CaCl2处理细菌：即用低渗CaCl2溶液在0时处理快速生长的细菌，从而获得感受态细菌。此时细菌膨胀成球型，外源DNA分子在此条件下易形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物粘附于细菌表面。,（二）DNA进入细胞：通过热激作用促进细胞对DNA的吸收。然后将细菌接种于含相应抗生素的培养基上，含有重组子的感受态细菌将形成单菌落。这时可挑选单菌落进行相应的筛选及鉴定分析。,二、噬菌体转染受体细胞,噬菌体能将自身的DNA分子注入到宿主细胞内，但DNA分子必须被噬菌体的蛋白包装形成成熟的噬菌体颗粒以后才能完成感染过程。因而

46、应用噬菌体载体转导外源DNA必须先完成体外包装。,体外包装(in vitro packaging)是指在离体条件下，将提取的包装蛋白与DNA混合，产生噬菌体颗粒的过程。通过噬菌体的释放和感染将DNA从一个细胞转移到另一个细胞的过程称为转导(transduction)，而通过转导接受外源DNA的细胞称为转导子(transductant)。,第六节 阳性重组子的筛选和鉴定,一、根据遗传表型筛选 二、应用限制性内切酶酶切分析筛选 三、核酸探针筛选 四、PCR筛选 五、菌落原位杂交技术,一、根据遗传表型筛选,1抗生素平板筛选2互补筛选3插入表达筛选 4噬菌斑筛选,1抗生素平板筛选,大多数克隆载体均带有

47、抗生素抗性基因，常见的有抗氨苄青霉素基因(Ampr)、抗四环素基因(Tetr)、抗卡那霉素基因(Kanr)等。如果外源DNA片段插入载体的位点在抗药性基因之外，不导致抗药性基因的插入失活，仍能编码抗药性基因，这种含有重组子的转化细胞能够在含有相应药物的琼脂平板上生长成菌落。,但是除阳性重组子以外自身环化的载体、未酶解完全的载体以及非目的基因插入载体形成的重组子均能转化细胞而能生长，故本法仅是阳性重组子的初步筛选。,同样还可应用插入失活双抗生素对照筛选法，在含有两个抗药性基因的载体中，通过插入插入失活其中一个基因，可用两个分别含有同药物的平板对照筛选阳性重组子。,Ampicillin resis

48、tant?yes yesTetracycline resistant?No yes,B X B,B,B,X,Ampr,ori,Ampr,Tcr,ori,Screening by insertional inactivation of a resistance gene,Replica plating:transfer of the colonies from one plate to another using absorbent pad or Velvet(绒布).,transfer of colonies,+ampicillin,+ampicillin+tetracycline,these

49、 colonies have bacteria with recombinant plasmid,2互补筛选：,利用-半乳糖苷酶基因构建的载体如pUC系列的质粒常采用互补筛选。载体中带有大肠杆菌Lac操纵子的调节序列和编码-半乳糖苷酶N末端145个氨基酸的序列（亚基）。用IPTG可诱导这个片段的合成，合成的片段能与宿主编码的-半乳糖苷酶C末端序列（亚基）进行基因内互补，恢复该酶的活性，这一过程称-互补。,因此当载体带有LacZ调节序列和编码半乳糖苷酸N末端145个氨基酸的序列，而宿主中该部分序列缺陷、其他部分完整时，虽然宿主编码的或质粒编码的片段本身都没有活性，但它们互相协助则可在大肠杆菌内形

50、成一个具有酶活性的蛋白质。故在诱导物IPTG存在下，细菌在含色素底物X-gal培养基的平板上可形成蓝色菌落。当在质粒多克隆位点中插入外源DNA时，可使-半乳糖苷酶的氨基末端失活，从而不能进行互补，因此带有重组质粒的细菌产生白色菌落。,若在多克隆位点插入外源基因，将使lac Z基因片段灭活，不能与宿主菌产生-互补现象，当外源诱导物IPTG和人工底物X-gal加入后，底物不被转化，不能生成蓝色菌落，而保持白色。基于-互补原理的筛选方法又称为“蓝-白斑筛选”,重组子,(5-溴-4氯-3-吲哚-D-半乳糖苷),3插入表达筛选：,有些载体设计时，在筛选标志基因前面连接一段负调控序列，当插入失活该负调控序