第3章细胞工程10.ppt

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1、第3章 细胞工程,2,contents,3.1 细胞工程的基本技术,细胞工程实验室的常见设备细胞培养的基本方法,3,3.1.1细胞工程实验室的常见设施,灭菌锅电热干燥箱超净工作台倒置显微镜细胞计数板,4,电热鼓风干燥箱,手提式高压灭菌锅,立式高压灭菌锅,垂直双人双面超净工作台,离心机光照培养箱CO2培养箱液氮罐,5,倒置显微镜细胞计数板,动物细胞培养中用于观察细胞的生长状况及计数。,6,CO2培养箱（动物细胞培养）,光照培养箱（植物细胞培养）,CO2培养箱主要控制模拟活体内环境相关的3个基本变量：稳定的CO2水平、温度、相对湿度。,7,液氮罐（用于冻存培养的动物细胞）,8,3.1.2 细胞培养

2、的基本方法无菌操作,细胞工程的所有试验都要求在无菌条件下进行，要求十分严格的无菌操作。1、准备室、接种室、培养室（紫外线、熏蒸等）；2、超净工作台、高压灭菌设备、过滤器；3、生物材料的消毒（酒精、升汞、次氯酸钠等）；4、试验器械、器皿的灭菌（干热、湿热）；5、药品、培养基的灭菌（湿热、过滤）；,9,细胞培养技术,细胞培养是指动物、植物或微生物细胞在体外无菌条件下的保存和生长。(微生物培养、植物细胞培养、动物细胞培养)基本步骤包括：获取原材料及除菌；配制培养基，对培养基进行灭菌；接种、培养和传代。,10,细胞融合技术,离体条件下将不同生物或同种生物不同类型的单细胞通过无性方式融合成一个杂合细胞的

3、技术。单克隆抗体细胞融合技术的主要过程：制备原生质体（植物）；诱导细胞融合（化学融合剂介导、电融合、病毒融合剂介导等）；筛选杂合细胞。,11,核移植,用机械的办法将供体细胞的细胞核转移至另一个受体细胞（去除细胞核）中，并使这个重组细胞进一步发育、分化。克隆羊Dolly,12,3.2 植物细胞工程,13,细胞的全能性(totipotence),1902年：德国植物学家哈伯兰德（Haberlandt）就预言，植物细胞具有全能性，即植物活细胞具有能够发育成为完整植株的潜在能力。1943年，怀特明确提出了“植物细胞全能性”学说：每个植物细胞具有该植物的全部遗传信息和发育成完整植株的能力。植物细胞的全能

4、性，是植物细胞工程创立的重要理论基础。,1997年多利羊诞生证明了动物细胞全能性,3.2.1 几个基本概念,*,14,外植体、愈伤组织,外植体：从健康植株的特定部位或组织，选择用于组织培养的起始材料，称之为外植体。可以是器官、组织、细胞和原生质体等（如：花粉、茎段、叶片、茎尖、胚等）。愈伤组织：原指从植物的伤口部位生成的脱分化的薄壁细胞团。组织培养时,则指在培养基上从外植体上长出的一团无序薄壁细胞。它具有再分化成为完整植物体的潜能。,水稻幼胚,水稻愈伤组织,*,15,细胞分化、脱分化、再分化,分化（diffrentiation)：细胞的形态、构造和功能发生变化，如花芽分化，木质部分化，不定胚分

5、化；脱分化（dediffrentiation)：培养条件下使一个已分化的细胞回复到原始无分化状态或分生细胞状态的过程就是细胞脱分化；再分化（rediffrentiation)：将脱分化的母细胞再培养成分化细胞，并且形成组织或器官以及生物体；,水稻幼胚,水稻愈伤组织,脱分化,分化出苗,再分化,16,植物细胞培养的培养基,糖（碳源），氨基酸，维生素等,水：,大量元素：K,Ca,Mg,P,S等微量元素：Cl,Fe,Mn,B,Zn,Cu,Co等,无机营养：,蒸馏水或去离子水,有机营养：,生长调节物质：,生长素：2，4D，NAA，IAA等。促进根的分化细胞分裂素：6BA，玉米素，激动素等，促进芽的分化,

6、天然附加物：,椰乳，酵母提取物，麦芽浸出物等,植物生长所必须的元素：大量元素（9种）：C、H、O、N、K、Ca、Mg、P、S微量元素（7种）：Cl、Fe、Mn、B、Zn、Cu、Mu,*,17,3.2.2 组织培养的基本方法,进行植物组织培养，一般要经历以下五个阶段：,1.材料的准备；2.接种与培养；3.继代增殖；4.诱导分化、生根成芽；5.移栽、炼苗成活。,*,18,水稻幼胚,水稻成熟胚,愈伤组织,分化出苗,诱导成芽,诱导生根(底面观),诱导生根（侧面观）,移栽、炼苗,19,20,3.2.3 快速繁殖技术,植物快速繁殖技术（快繁）：利用组织培养方法将植物体某一部分的组织小块，进行培养并诱导分化

7、成大量的小植株，从而达到快速无性繁殖的目的。也称为试管苗繁殖或微体繁殖。,快繁技术最早在兰花工业上获得成功。在20平方米的培养室内，最多可容纳100万株试管苗。,*,21,22,3.2.4 植物脱毒技术,是植物快繁的一个分枝1952 年，法国科学家首次建立了生长点培养成株的脱毒法，从而开创了防治植物病毒病的新途径。对植物病毒病迄今已采用的生物、物理、化学等多种防治途径均收效甚微，有的毫无成效。因此，过去人们只能采取拔除并消毁病株的消极方法。,23,原理,在感染病毒的植株中，病毒的分布是不一致的。老叶片及成熟组织和器官中，病毒含量较高，但幼嫩的和未成熟的植物部位（如茎尖分生组织），病毒的含量较低

8、，而在生长点约0.11 毫米时，则几乎不含病毒颗粒。这是由于病毒的繁殖运输速度与茎尖细胞生长速度不同所致。在茎尖分生组织中，细胞繁殖十分迅速，病毒还来不及侵入，因此就成为植物体相对无病毒的特殊区域。,24,采取不含病毒颗粒或病毒颗粒含量甚少的0.10.5 毫米带12 个叶原基的茎尖作为外植体，进行微繁殖，使其培养成完整的无病毒小植株的技术。所取的外植体很小，分离难度大，一般在解剖镜下操作。马铃薯、洋葱、大蒜、兰花、菊花、康乃馨、水仙、唐菖蒲、香蕉、苹果、柑橘、葡萄等。,25,华中农大马铃薯脱毒试管苗 http:/,3.2.5 次生物质与植物细胞的大量培养,次生代谢产物是指生物中一大类并非生长发

9、育所必需的小分子有机化合物，其产生和分布通常有种属、器官组织和生长发育期的特异性。那些应用价值高，价格昂贵，资源不足，难以进行化学合成的植物次生物质，用细胞培养生产才会有经济上的效益。,26,1956年，提出工业化培养植物细胞以生产其天然产物。之后，用此方法生产了紫草宁、哈尔碱、麻黄碱、人参皂角苷、紫杉醇等。,本草纲目中所开列的1892种药物中绝大多数是植物；目前约有25%的法定药品来自植物。,27,第一个商品化的细胞大规模培养的植物是紫草。1983年，日本三井石油化学工业公司利用紫草细胞大规模培养生产紫草宁，最终浓度达1400mg/L，宣布把紫草宁作为燃料和药物进行工业化生产。,在摇床扩大培

10、养的长春花细胞,紫草,我国已经建立了人参、三七、西洋参、三尖杉、紫草、洋地黄、长春花、丹参、红豆杉等40多种药用植物的液体培养系统，并对长春花、人参、紫草、红豆杉等进行大规模培养的探索。,长春花,28,红豆杉,红豆杉树皮中提取的紫杉醇对治疗卵巢癌和乳腺癌有特效。这种物质的碳环结构十分特殊，难以通过化学合成获得。然而要治好一个卵巢癌病妇，至少需要23 棵60 老龄的此种树的树皮。这种树属于稀有树种，且生长很慢，若不断取用的话，很快就要面临濒危的境地。,我国传统药材生物技术产物第一个商品化的例子：人参，中国药科大学组培室,人参,29,3.2.6 原生质体培养与细胞融合,是指将不同来源的原生质体(除

11、去细胞壁的细胞)相融合并使之分化再生、形成新物种或新品种的技术。可以避开生殖细胞的受精过程，在亲缘更远的物种间实现基因转移，创造出自然界中所没有的新物种。目前仍以种内和种间的细胞杂种为主。,显微镜下的细胞融合过程,30,细胞融合的方法,物理法（电）、化学法（化学融合剂）及生物法（病毒融合剂）。原理：增加细胞间的粘附、改变膜的通透性随机结合、融合植物细胞融合常用PEG法和电融合法。,目前，最常用的植物细胞融合技术，有高国楠建立的使用化学融合剂PEG（聚乙二醇）的融合技术（1974），森达和乔默尔曼创立和发展的电融合技术，以及斯维格（1987）将电融合与微培养结合起来的技术。,31,植物原生质体融

12、合过程,32,3.2.7 人工种子,人工种子又称人造种子，这是细胞工程中最年轻的一项新兴技术。由英国科学家于1978年提出的。天然种子，一般都是由种皮、胚乳和胚三部分构成。人工种子是由体细胞胚、人工胚乳和人工种皮三个部分组成。,33,体细胞胚,胚不一定从受精卵发育来，尤其在植物界，往往可以看到未受精的卵细胞或胚囊细胞、珠心细胞等发育成胚的现象。由体细胞发育成的类似于合子胚的结构成为胚状体或体细胞胚，简称体胚。体胚具有两极性，可从方向相反的两端分化出茎和根。因此，体胚可以一次性再生成完整植株。把体胚包埋在胶囊内形成球状结构，使其具备种子机能。所以，人工种子是一种人工制造的代替天然种子的颗粒体，可

13、以直接播种于田间。,http:/,马铃薯人工种子,*,34,包埋介质海藻酸钠,这种物质在0.1M氯化钙溶液中可以迅速固化成透明的小胶球。海藻酸价格低廉，质地柔软无毒性，还可人为地在其中加入各种营养物质和生长调节剂，因此是一种，迄今为止已发现的比较理想的体细胞胚包埋剂。,美国的一个研究组花了近两年时间，从百余种材料中筛选到目前广泛使用的人工种子包埋介质海藻酸钠。,35,三大难题有待克服,许多重要植物还不能培养出大量的高质量的体细胞胚。现有的人工胚乳和种皮还不够理想，不能有效地防止微生物的腐蚀。人工种子的贮藏有待进一步完善。,目前已制成模式性人工种子的植物十余种，但距离实际应用还有很大距离。,36

14、,要点,外植体、愈伤组织、体细胞胚、人工种子植物细胞培养的优点？植物组织（细胞）培养的基本过程？植物脱毒技术原理？植物原生质体如何制备？植物细胞融合的方法？植物细胞工程有何应用前景？,37,3.3 动物细胞工程,3.3.1 动物细胞培养3.3.2 动物细胞培养的基本过程3.3.3 体外培养的动物细胞的生长类型3.3.4动物细胞培养条件3.3.5 动物细胞的冻存与复苏3.3.6 动物细胞培养应用,38,3.3.1 动物细胞培养,动物细胞（组织）培养：从动物体内取出细胞（或组织），模拟体内的生理环境，在无菌、适温和丰富的营养条件下，使离体细胞（或组织）生存、生长并维持结构和功能。起源于19世纪所应

15、用的某些胚胎学技术。奠基人:美国生物学家哈里森。在1907年采用盖玻片覆盖凹窝玻璃悬滴培养法将蛙胚的神经组织培养在淋巴液中，保持存活了几周时间，并观察到细胞突起的生长过程。,39,培养器具,过滤器,离心管,培养瓶,冻存管,40,几个概念,原代培养期（10代细胞以内）传代培养期（10代细胞以后）细胞株：（10-50代细胞）细胞系：（50代细胞以后，细胞发生了癌变）,41,原代培养(primary culture),把第1代细胞的培养与传10代以内的细胞培养统称为原代培养。,过程：从动物机体中取出组织 剪碎 加胰蛋白酶 细胞游离 加培养液 将细胞接种到培养瓶内 培养（12天换一次培养液）细胞贴壁生

16、长 长成单层细胞,*,细胞接种后一般几小时内就能贴壁，并开始生长，如接种的细胞密度适宜，5天到一周即可形成单层。,42,传代培养(subculture),体外培养的原代细胞或细胞株要在体外持续地培养就必须传代，以便获得稳定的细胞株或得到大量的同种细胞，并维持细胞种的延续。培养的细胞形成单层汇合以后，由于密度过大生存空间不足而引起营养枯竭，将培养的细胞分散，从容器中取出，以1:2或l:3以上的比率转移到另外的容器中进行培养，即为传代培养。,*,43,细胞株：从原代培养细胞群中筛选出进行传代培养的细胞，能传到40-50代，其遗传物质没有发生变化。,细胞系：体外培养的动物细胞传到40-50代后有部分

17、细胞遗传物质发生了变化，带有癌变的特点，可能在培养条件下无限制的传代下去，这种传代细胞称为细胞系。,*,44,在进行动物细胞培养时，用胰蛋白酶分散细胞，说明细胞间的物质主要是蛋白质。动物细胞培养适宜的pH为7.27.4，此环境下胃蛋白酶（最适pH2.0）没有活性，而胰蛋白酶(7.2-8.4)的活性较高。,3.3.2 动物细胞培养的基本过程,选材：多选择动物胚胎或幼龄动物的组织、器官，因为它们细胞增殖能力强，分裂旺盛，分化程度低，容易培养。,45,基本过程：,动物胚胎或幼龄动物的组织、器官,细胞悬浮液,胰蛋白酶,10代细胞,原代培养的细胞,50代细胞,细胞株,无限传代,细胞系,单个细胞,加培养液

18、,遗传物质未改变,动物组织细胞间隙中含有一定量的弹性纤维等蛋白质，将细胞网络起来形成具有一定弹性和韧性的组织和器官。,（分解弹性纤维）,遗传物质已改变,*,46,3.3.3 体外培养的动物细胞的生长类型,离体培养的动物细胞可分为三类：贴壁依赖性贴壁非依赖性兼性贴壁细胞。,47,贴壁依赖性细胞,动物细胞培养中，大多数哺乳动物细胞需有给予贴附的支持物表面，细胞依靠自身分泌的或培养基中提供的贴壁因子才能在该表面上生长、增殖。这样的细胞称为贴壁细胞；当细胞布满表面后即停止生长，这时若取走一片细胞，存留在表面上的细胞就会沿着表面生长而重新布满创面。要求：培养瓶或培养皿的内表面光滑、无毒、易于贴附。,*,

19、48,接触抑制（contact inhibition）,当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞就会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的接触抑制。正常二倍体细胞的生长寿命是有限的，而异倍体细胞无接触抑制现象，其寿命是无限的，如肿瘤细胞。,*,49,肺癌细胞SPC-A1（上皮样）,肝癌细胞SMMC-7721（成纤维样）,50,培养中的胃癌细胞MGC-803（多层）,51,贴壁非依赖性细胞,体外生长不必贴壁，可在培养液中悬浮生长，细胞透明度较大，边缘不是那么清晰，故也叫悬浮型细胞。一些在体内原本就以悬浮状态生长的细胞，当接种于体外环境中也可以以悬浮状态生长。血液白细胞、淋巴组织细胞，某些肿瘤细胞、杂交

20、瘤细胞、转化细胞系等都属此类细胞。这类细胞形态学特点是胞体始终为球形。,兼性细胞,生长不严格依赖支持物。如中国地鼠卵巢细胞，小鼠L929细胞。,52,3.3.4动物细胞培养条件,1、无菌、无毒的环境（添加一定量的抗生素，定期更换培养液）2、营养要求高（葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素、动物血清等。）3、环境要求高：温度和pH 36.5+0.5度,7.2-7.44、气体环境：O2和CO2（95%空气和5%CO2）,保证细胞顺利的生长增殖,不同血清对细胞作用不同。以小牛血清最好，成年牛和马血清次之。,53,3.3.5 动物细胞的冻存与复苏,冷冻保存：将体外培养物或生物活性材料悬浮在加有或不加冷冻保护

21、剂的溶液中，以一定的冷冻速率降至零下某一温度（一般是低于-70的超低温条件），并在此温度下对其长期保存的过程。复苏：以一定的复温速率将冻存的体外培养物或生物活性材料恢复到常温的过程。在复苏时，一般以很快的速度升温，1-2分钟内即恢复到常温。,*,54,冷冻保存方法,最常用的方法：利用各种温级的冰箱分阶段降温至-70-80，然后直接投入液氮进行保存；或者是利用电子计算机程控降温仪以及利用液氮的气、液，按一定的降温速率从室温降至-1000C以下，再直接投入液氮保存的方法。以该种方法冻结的细胞悬液或多或少都有冰晶的形成。,55,获得细胞或细胞产物,细胞的全能性,细胞株、细胞系,植物个体或细胞,培养结

22、果,快速繁殖、培育无病毒植株等,培养目的,葡萄糖、动物血清,蔗糖、植物激素,培养基特有成分,液体培养基,固体培养基,培养基性质,细胞增殖,原理,动物细胞培养,植物组织培养,比较项目,植物细胞和动物细胞培养的比较,56,3.3.6 动物细胞培养应用,利用体外培养的动物细胞来大规模生产生物制品（病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体）获得大量自身的皮肤细胞，用于植皮培养的动物细胞可以用于检测有毒物质，判断某种物质的毒性为治疗和预防癌症及其他疾病提供理论依据,57,小结,贴壁细胞、接触抑制、原代培养、传代培养、细胞株、细胞系、冻存、复苏培养的动物细胞有哪些生长特性？动物细胞培养与植物细胞培养有何不同？动物细胞

23、培养的应用？动物细胞融合的常用方法？,58,3.4 单克隆抗体,长期以来，为了获得抗体，采用的是把某种抗原反复注射到动物体内，然后从动物血清中分离出所需抗体的方法。用这种方法获得的抗体，只能是混合抗体,产量低，特异性差，纯度低，反应不够灵敏。人们发现，在动物发生免疫反应的过程中，体内的B细胞可以产生多达百万种以上的特异性抗体，但是每个B细胞只分泌一种化学性质单一、特异性强的抗体。要想获得大量的单一抗体，必须用单个B细胞进行无性繁殖，即克隆。,59,什么是抗体？由何种细胞产生？主要分布在哪里？起何作用？什么是单克隆抗体？,B细胞,血清,特异性免疫作用,抗体：机体受抗原刺激后产生的，并且能与该抗原

24、发生特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。,用单个B淋巴细胞进行无性增殖（扩增），也就是通过克隆，形成细胞群，这样的细胞群就有可能产生出化学性质单一、特异性强的抗体 单克隆抗体,3.4.1几个基本概念,60,传统抗血清,抗 原,免 疫,所有抗体混合,1,2,3,4,脾 脏,淋巴结,B细胞,一种抗原通常具有多个不同的抗原决定簇，因此能刺激多个B淋巴细胞产生相应的单克隆抗体，因此血清中的抗体是针对不同抗原决定族的单克隆抗体混合物，称为多克隆抗体。,传统方法获得的抗体是多克隆抗体(混合抗体),61,设计方案：一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体小鼠骨髓瘤细胞能无限增殖,化学性质单一、特异性强，只针对一种抗

25、原决定簇的抗体。,杂合细胞,单克隆抗 体,3.4.2单克隆抗体的制备过程,*,62,1975年，英国剑桥大学分子生物学研究室将已适应于体外培养的小鼠骨髓瘤细胞与用绵羊红细胞免疫过的小鼠脾细胞（B淋巴细胞）进行融合，发现融合形成的杂交瘤细胞具有双亲细胞的特征：即像骨髓瘤细胞一样在体外培养中能够无限地快速增殖，又能持续地分泌特异性抗体。,63,单克隆抗体制备过程,注射抗原,细胞融合、筛选,足够数量的、能产生特定抗体的细胞群,体外培养,注射到小鼠腹腔,单克隆抗体,诱导其融合的方法有哪些？,两次筛选分别有什么目的？,为什么选用小鼠骨髓瘤细胞与B细胞融合？,*,64,杂交瘤细胞产生单克隆抗体示意图,65

26、,动物免疫与免疫脾细胞悬液的制备,腹腔注射、皮下淋巴样器官注射、静脉注射、皮内注射、肌肉注射等如果需要免疫脾细胞，一般取最后一次加强免疫3天以后的脾脏，制备成细胞悬液。,BALB/c mouse,单克隆抗体制备过程,66,小 白 鼠 免 疫 流 程,抗原混合弗氏完全佐剂进行初次免疫,至少三次相同剂量的加强免疫,最后一次加强免疫,取出脾脏，制备细胞悬液，细胞融合,BALB/c,02468101214wk,加佐剂制成乳剂,佐剂:能使抗原缓慢释放，以便延长抗原与免疫系统接触的时间；产生高亲和力的免疫应答,67,免疫后取出脾脏,68,脾脏为B细胞集中地,取出脾脏内细胞（无菌条件下操作。）,69,PEG

27、介导细胞融合,细胞融合2 min,加入 PEG,70,培养、筛选,融合后的细胞均分在96孔板中,HAT培养基：这一步筛选，主要是筛选出杂合的瘤细胞。,71,融合后的细胞生长状况,刚融合完成,一个癌细胞与两个脾脏细胞,经数次分裂后,稳定的细胞群落,Juang RH(2003),72,PEG,脾脏细胞,骨髓瘤细胞,细胞融合,HAT初步筛选杂合细胞,ELISA筛选抗体,m,m,2,m,1,4,3,m,73,3.4.3 单克隆抗体的应用,医学检验试剂：主要用于特异性、敏感性要求高的的实验技术中，如传染病的快速诊断；寻找肿瘤特异性抗原及检测肿瘤相关抗原；免疫细胞抗原检测，等等（主要是利用抗原抗体的特异性

28、反应检测特异性抗原）。导向治疗：生物导弹或免疫导弹抗原物质的分离和提纯：亲和层析中作为配体，可筛选特异性抗原物质,74,3.5 核移植与克隆动物,75,克隆的本意是指遗传上完全相同的分子、细胞或来自同一祖先的生物个体的无性繁殖群体（植物界试管植物；微生物分裂增殖；动物界孙悟空）。,克隆,1几个基本概念,76,（动物细胞的）核移植,将供体细胞核移入去核的卵母细胞中,使后者不经精子穿透等有性过程即可被激活、分裂并发育,使得核供体的基因得到完全复制。,77,1938年，德国胚胎学家汉斯斯皮曼建议用成年的细胞核植入卵子的办法进行哺乳动物克隆。1952年，美国人罗伯特布里格斯和T.J.金对豹蛙发育到胚囊

29、期的胚胎细胞做移核试验，成功地获得了一个可以摄食的豹蛙幼体。1962年，美国的发育生物学家约翰格登宣布他用一个成年细胞克隆出一只蝌蚪，从而引发了关于克隆的第一轮辩论。1984年，英国剑桥大学生物学家斯蒂恩威拉德森用胚胎细胞克隆出一只羊。这是第一例得到证实的克隆哺乳动物。,2动物克隆的发展历史,1960年代初鱼类核移植工作在由中国实验胚胎学家童第周最早开展。,78,里程碑式的突破,英国罗斯林（Roslin）研究所维尔穆特(Wilmut)博士1997年2月27日在Nature宣布用乳腺细胞的细胞核成功克隆出一只绵羊“多莉(Dolly)”。,维尔穆特等试验的生物学意义是证明了哺乳动物的体细胞也具有全

30、能性。在此之前，人们从未能从哺乳动物的已分化的体细胞再培育出基因相同的个体。但是，他们的试验尚未解决直接从体细胞培养成成体的问题，他们还需借助于卵细胞，即还要依赖卵细胞的细胞质。,79,克隆“多莉”示意图,一只怀孕三个月的芬兰多塞特母绵羊，提供了全套遗传信息，即提供了细胞核（称之为供体）；两只是苏格兰黑面母绵羊。一只提供无细胞核的卵细胞（受体）；另一只提供羊胚胎的发育环境子宫，是“多莉”羊的“生”母（代孕母体）。,3哺乳动物进行克隆的基本过程,*,80,具体操作,从一只岁芬兰多塞特白面母绵羊（）的乳腺中取出乳腺细胞，将其放入低浓度的营养培养液中饥饿，细胞逐渐停止分裂进入休眠状态而使全部基因具有

31、活性，此细胞称之为“核供体细胞”；注射促性腺激素GN促使母羊（苏格兰黑面母绵羊）（）排卵，2833h后从卵巢中取出未受精的卵细胞快速去除细胞核，放入10%FCS（小牛血清）、1%FCS和0.5%FCS连续5天，饥饿使进入G0期做受体细胞；,81,利用电脉冲融合方法，使供体细胞和受体细胞融合，最后形成“融合细胞”。电脉冲可以产生类似于自然受精过程中的一系列反应，使融合细胞也能像受精卵一样进行细胞分裂、分化，从而形成“胚胎细胞”；将胚胎细胞转移到另一只苏格兰黑面母绵羊（）的子宫内，胚胎细胞进一步分化和发育，最后形成小绵羊-多莉，它具有供体母羊（A）全套的遗传物质，也为白色。,82,成功率始终很低，

32、具有极大的偶然性和随机性。277个绵羊胚胎1个多莉；夭折率高，不少克隆动物天生患有疾病或体形过大；没有遗传物质的交流和互补，将会加剧一些遗传疾病的发生。,4存在问题,Dolly的命运：2003年2月14日，多莉因肺部感染无法治愈而死亡，“享年”不足7岁。肺部感染是11-12岁的老年羊的常见病。1999年，法国全国农业研究所的克隆牛犊出生一月后死亡。尸体解剖发现其脾脏、胸腺等组织未正常发育。,83,1998年，美国夏威夷大学 T.Wakayama 等率先在雌性小鼠上进行了成年体细胞克隆。1998年，日本成功进行体细胞克隆牛。1998年，新西兰科学家从一头珍稀牛克隆后代。1999年，美国夏威夷大学

33、从雄性小鼠尾尖取材，获得克隆雄鼠。2000年，杨向中博士领导的实验室在美国从体外培养 6-13 代的细胞克隆出 6头公牛。2000年，美国从衰老细胞克隆出 6 头小牛。2000年，英国从成年动物体细胞克隆出 5 头猪。2000年，中国西北农林科技大学从 4 岁山羊耳上取细胞体外培养，克隆出1头山羊。2001年，体细胞克隆狗诞生。2001年，体细胞克隆兔诞生。2002年，体细胞克隆猫诞生。2003年，体细胞克隆猴诞生。2004年，体细胞克隆大鼠诞生。2005年，体细胞克隆马诞生。,84,应用价值及意义,检验动物细胞全能性 加速动物繁殖、优良育种、保护珍贵动物。生殖性克隆克隆动物的遗传背景相同，因

34、此它们是模拟疾病、基因治疗、器官移植等研究的良好实验材料，具有良好的稳定性和重复性。可以用患者本人细胞培育出新组织（器官移植）。治疗性克隆,85,5生殖性克隆,人体细胞克隆技术,生殖性克隆（克隆人）,治疗性克隆（克隆胚胎）,出于医疗目的而在实验室使用克隆技术制造胚胎，然后取出胚胎干细胞进行体外培养以获得再生组织或器官的过程。,“生殖性克隆”：,*,指出于生殖的目的使用克隆技术在实验室制造人类胚胎，然后将胚胎置入人类子宫发育成胎儿和婴儿的过程。基于尊重人类尊严的伦理学考虑，目前世界各国政府严禁生殖性克隆。,“治疗性克隆”：,86,克隆人类？,将普通的体细胞（男性或女性来源均可）和一枚女性卵子结合

35、起来（储存于女性卵子中的遗传信息将事先被消除）。通过细胞分裂形成的胚胎应只带有这名供体的全部遗传信息，最后将胚胎移植到女性子宫中，将获得该供体人类的克隆后代。,87,社会、伦理问题,他（她）是正常人吗？该如何看待他（她）？他（她）的父母是谁？谁生育了他（她）？谁爱他（她）？有可能产生真正相同的克隆的孪生子吗？,Who am i？,不管克隆技术怎样发展，克隆人怎样产生，都是人，与被克隆人实质上是存在着年龄差的同胞胎。但就是这一点让人们觉得很难应对克隆人出现的伦理关系。,这个孩子就是人类的试验品，这位代孕的母体起到的也仅仅是一个生育机或孵化器的作用。,88,英雄、伟人能够克隆吗？身体上任何一部分的

36、细胞是否都可以用来克隆？人可以无休止地被克隆吗？任何克隆动物都有基因上的缺陷。克隆羊和克隆牛都有体形过度庞大的问题。该缺陷在克隆鼠身上也存在。克隆牛、羊、猪都存在发育不良、免疫系统 缺陷和心肺功能不健全的问题。那么，克隆人呢？,89,克隆人是否是人类文明的倒退？（有性生殖，无性生殖克隆）,90,1998年1月，欧洲19个国家在法国巴黎签署了一项有关严格禁止克隆人的协议。这是国际上第一个禁止克隆人的文件。它禁止各签约国的研究机构或个人使用任何技术创造与一个活人或死人基因相似的人，否则将重罚。美国：2001年7月31日，美国国会众议院通过了一项全面禁止克隆人的法案。美国总统布什表示“百分之百”反对

37、克隆人的研究，并已多次敦促参议院通过禁止克隆人的法案。英国：1990年通过的人类授精和胚胎学法案，认为克隆人类胚胎的研究是非法的。2001年11月22日英国政府公布一项新法案，明确禁止通过克隆技术复制人类个体，即“繁殖性克隆”，成为世界上第一个立法反对生殖性克隆的国家。德国：1991年德国实行胚胎保护法，严格禁止人类胚胎干细胞研究以及克隆胚胎干细胞。2000年11月，德国卫生部提出一项新的生殖医学法草案，再次强调在德国不允许进行胚胎干细胞的培育研究。意大利：2001年3月，意大利众议院批准了政府于1998年签署加入欧洲禁止克隆人协议。日本：2000年4月14日，日本内阁会议通过关于限制对人的克

38、隆技术的法律草案，禁止克隆人，违者最高将被判处5年徒刑。,世界一些国家对克隆人研究的态度：,91,从需要救治的病人身上提取体细胞将该细胞的遗传物质置入一个去除了细胞核的卵细胞该卵细胞开始自行分裂，直至形成一个早期胚胎从这早期胚胎中提取胚胎干细胞胚胎干细胞经过相应的技术处理，便可发展成遗传特征与病人完全吻合的细胞、组织或器官,以前器官移植治疗方法中经常出现的排异反应问题因此得到了彻底解决血细胞、脑细胞、骨骼和内脏等都将可以更换癌症、白血病、帕金森氏症、心脏病等顽疾也有望得到有效的治疗与治愈由于从早期人类胚胎中提取的干细胞拥有形成所有的人体细胞类型的能力，因而它也就有可能成为21世纪最重要、最理想

39、的人体器官替代物的原料。,6治疗性克隆,*,92,治疗性克隆人兽混合胚胎,中国最早进行人兽混合胚胎实验，现已中断http:/http:/,人卵子的来源有限，无法大规模进行。为此科学家们就考虑把人的体细胞移植到去核的动物卵母细胞中，让其发育成为一个混合的异种克隆胚胎进行胚胎干细胞研究，进行“胞质杂交”，获得完全具有人类性状的干细胞胚胎。由此培养出的胚胎干细胞可能帮助找到某些疾病的源头，如与脊髓有关的肌肉萎缩、帕金森氏症或阿尔茨海默氏症等。,进行人兽混合胚胎研究的目的主要是用于治疗性克隆研究。通过培育人兽混合胚胎，可以得到大量的干细胞。而干细胞可以分化成人体的各种组织和器官，在器官移植和探寻像帕金

40、森氏症、糖尿病等疾病的病因方面都有着广阔的应用前景。,93,小结,单抗、多抗、HAT培养基、治疗性克隆、生殖性克隆单抗的制备方法？应用？多利羊是如何克隆出来的？如何用体细胞克隆哺乳动物/鱼类？克隆动物有什么实际应用？将基因工程与克隆技术两者结合起来（即转移的细胞核DNA含有外源基因），能产生什么后果？（转基因动物，利用克隆技术）,3.6 干细胞,94,95,3.6.1定义,目前尚无统一的说法干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细胞。or具有多项分化潜能和自我复制、更新能力的原始未分化细胞，是形成各种组织器官的祖宗细胞。,*,96,来源,胚胎干细胞（embryonic stem cells,ES

41、C）：指处于胚胎早期的干细胞。分化潜能宽，具有分化为机体任何组织细胞的能力，如囊胚期(受精后57天)内细胞团的细胞、原始生殖细胞,3.6.2干细胞的分类,成体干细胞（adult stem cell，ASC）：具有自我更新能力，但分化潜能窄，只能分化为相应(或相邻)组织器官组成的细胞，如：骨髓、大脑、神经、皮肤、胰腺、角膜、脂肪、心脏、肝脏等组织源干细胞,*,97,分化潜能,单能/专能/偏能/定向干细胞：只能向一种类型或密切相关的两种类型的细胞分化。如上皮组织基底层的干细胞、肌肉中的成肌细胞(卫星细胞)。,全能干细胞：具有形成完整个体的分化潜能。如：受精卵、8个细胞期以前的卵裂球以及胚胎干细胞（

42、后者尚有争议）,多能干细胞（pluripotent stem cells）：具有分化出多种细胞组织的潜能，但失去了发育成完整个体的能力，发育潜能受到一定限制。如骨髓多能造血干细胞，它可分化出至少十二种血细胞，但不能分化出造血系统以外的其它细胞。,*,98,3.6.3干细胞的生物学特点,具有自我更新能力和不同程度的多向分化潜能终生保持未分化或低分化特征，缺乏分化标记能无限地分裂、增殖，可连续分裂几代，也可在较长时间内保持静止状态,*,99,干细胞有对称与不对称两种分裂方式,不对称分裂的结果使两个子细胞一个成为功能专一的分化细胞；另一个保持干细胞的特征。,100,3.6.4胚胎干细胞,ES细胞：由

43、早期胚胎（囊胚期/胚泡期）或原始性腺中分离出来的一类细胞（前者更常用），可冷冻保存，可进行遗传改造。,*,101,获得干细胞的四个途径,(1)从体外培养的早期胚胎获得；(2)从早期流产的胎儿中获得；(3)从克隆的胚胎中获得；(4)从成体中获得。,1从早期胚胎获得,1998年，美国威斯康辛大学Thompson研究小组就是从囊胚期胚胎的内细胞团中获得胚胎干细胞,102,体外受精卵,囊胚期,去除滋养层,发育,得5株干细胞系,32代(8个月)保持未分化状态,内细胞团,培养,传代,2从原始生殖细胞获得,103,gearhart小组：流产胎儿性腺嵴 原始生殖细胞 获得5个多能干细胞系 7个月不分化 思路：

44、原始生殖细胞是未分化细胞。,3体细胞核移植,104,分化细胞核(乳腺、皮肤细胞)去核卵细胞杂合细胞 发育成囊胚,移植到代孕母体子宫中，发育,成体(如多利羊),获得胚胎干细胞,分离出内细胞团,105,受精卵,卵裂期,桑椹胚,囊胚（内含囊胚腔）,原肠胚（内含原肠腔）,胎儿形成,(216细胞期)：在透明带内进行有丝分裂，细胞数量不断增加，但胚胎总体积并不增加，或略有减少。,由具有全能性细胞构成，细胞数在32个左右，排列紧密，形似桑椹，至此，细胞的分裂结束，下一个阶段开始细胞分化。,内细胞团：发育成胎儿各组织,滋养层细胞：发育成胎膜和胎盘,：最初发育在输卵管进行有丝分裂,哺乳动物的胚胎发育,滋养层外胚

45、层中胚层内胚层原肠腔,106,囊胚期,滋养层：发育成胚胎的附属结构或胚外结构，胚胎可通过这些组织从母体中获得正常发育所需的氧气和营养物质,内细胞团细胞：即胚胎干细胞，是一种未分化的细胞，具有全能性，能发育成完整的胚胎,滋养层,内细胞团,囊胚腔,囊胚的形成,桑椹胚,107,胚胎干细胞的培养（分离）,*,108,胚胎干细胞的培养,109,胚胎干细胞的应用前景,1）与基因治疗相结合2）再生医学：干细胞体外诱导分化成某一特定的细胞、组织、器官，进行移植，使之再建受损的组织甚至器官3)生物体发育机制研究等,*,干细胞有可能用于治疗人类几乎所有的组织坏死性或退化性疾病，它将是人类医疗史上的一次革命。,11

46、0,由胚胎干细胞到组织器官，仍然在研究当中,111,3.6.5胚胎干细胞研究的伦理争论,从体外受精人胚中获得的ES细胞在适当条件下能否发育成人？干细胞要是来自自愿终止妊娠的孕妇该如何办？为获得ES细胞而杀死人胚是否道德？是不是良好的愿望为邪恶的手段提供了正当理由？使用来自自发或事故流产胚胎的细胞是否恰当？如果胚胎干细胞和胚胎生殖细胞可以作为细胞系而可买卖获取，科学家使用它们符合道德规范吗？什么类型的研究可被接受？允许科学家为研究发育过程或建立医学移植组织而培养个体组织和器官吗？由于目前已接受人体基因可以插入动物细胞中，将人胚胎干细胞嵌入家畜胚胎中创立嵌合体来获得移植用人体器官是否道德？为了治疗

47、，改变来自有基因缺陷胚胎的ES细胞的基因，并使其继续发育成健康个体是否道德？如果人的替代组织极易获取，会不会有更多的人将不负责任地生活，而从事高风险的活动？http:/,112,3.7 iPS技术,iPS技术：诱导式多能干细胞技术。通过基因工程的方式将一些特定基因导入体细胞中，诱导这些体细胞重编程为类似干细胞的细胞。iPS细胞：诱导式多能干细胞(inducedpluripotentstemcell),3.7.1 iPS细胞核技术的定义、出现背景3.7.2 2006年：iPS在小鼠细胞上实现3.7.3 2007年：iPS在人类细胞上实现3.7.4 进展3.7.5 iPS细胞的应用,113,3.7

48、.1 iPS细胞核技术的定义、出现背景,iPS技术：诱导式多能干细胞技术。通过一定的方式（如转基因）将一些特定基因导入体细胞中，诱导这些体细胞重编程为功能上类似干细胞的细胞。iPS细胞(诱导式多能干细胞，inducedpluripotentstemcell)：是指体细胞经过基因重编程，回归到胚胎干细胞的状态，从而具有类似胚胎干细胞的分化能力,*,114,background,再生医学领域：器官移植（捐助的器官有限、异体移植会有免疫排斥反应）解决方法之一：直接采用多能干细胞进行器官再生（可惜通常所用的ES细胞来源于囊胚阶段的胚或者是受精后59周流产的胚胎，而且外来的ES细胞会有免疫排斥反应）之二

49、：治疗性克隆（采用核移植技术将患者自身体细胞的细胞核转移到捐助者的去核的卵细胞中，体外培养进行胚胎发育后获得人体早期胚胎，但目的不是将胚胎培育成人，而是从中提取胚胎干细胞，然后在合适的条件下，使其发育成为人体的任何一个器官，包括心、肺、肾、肝等。这些器官组织可用于医疗。由于涉及卵细胞的操作和对胚胎的破坏，会有一定的伦理、法律等的障碍。）涉及：核移植技术和干细胞的分离与培养两个领域。,115,iPS出现的前提：,受精卵可发育成个体说明卵细胞具有分化全能蝌蚪的分化细胞（肠）的细胞核移植进卵细胞后可指导其发育成个体（50年代）说明：未受精的卵子中的细胞质存在一些因子，可以改变基因表达的模式，将已分化

50、的细胞核转变为未分化的细胞核。这称为重编程。（DNA序列未变化，但表观遗传上有变化，包括DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质结构等）以小鼠为对象重复青蛙的实验获得克隆小鼠说明：哺乳动物的未受精的卵子中也存在可进行重编程的因子后来发现：可对体细胞核进行重编程的不仅仅有卵子，胚胎干细胞也具有同样的功能（体细胞核移植到去核的胚胎干细胞中，也可使之胚胎发育成个体）,核移植技术胚胎干细胞的体外培养（1980年：小鼠、1998年：人类）,推断：体细胞进行核移植到去核的卵细胞或者胚胎干细胞中，均可使新细胞具有发育全能/多能，或者说卵细胞和胚胎干细胞中存在的特殊的因子，可使体细胞转变为未分化状态（如果将其应用于人