第5章RNA剪接和加工.ppt

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1、1,第五节 RNA剪接和加工,大多数真核生物编码蛋白质的基因是不连续基因，内元与编码序列一起被转录。因此mRNA的原初转录产物是分子量很大的前体，分子大小极不均一。这些高分子量、不均一的核内RNA称为核内不均一RNA（heterogeneous nuclear RNA,hnRNA).hnRNA 经加工和选择性拼接，产生有功能的成熟的mRNA，释放到细胞质中。,2,细胞核内的RNA平均长度比mRNA大得多，且长短差异大，称为核不均一RNA（heterologous nuclear RNA，hnRNA）。hnRNA通常与蛋白质形成核蛋白颗粒，称为hnRNP。其中蛋白组分很多。,3,翻译,转录,末端

2、修饰,剪接,RNA剪接、加工均发生于核内,4,三类剪接系统:高等真核生物中，外显子-内含子边界、位于内含子内的短的保守序列，由一复杂的核蛋白组成的剪接器复合体对其识别，并切除内含子。有两组不同的内含子可发生自我剪接。酵母核前体tRNA内含子的切除。除核前体tRNA外，RNA的剪接都通过酯基转移（transesterification）反应切除。,5,（一）核RNA剪接的模式内含子两端没有长的同源或互补序列，但有极短的保守的共有序列，左端（上游）为GT，右端（下游）为AG。这一现象称为GT-AG规则。在RNA中则为GU-AG。,左端的位点也叫供体位点（donor site）或者5，右端也叫受体位

3、点（acceptor site）或者3。,一、核RNA的剪接,6,原则上5 可以和任何3 位点进行剪接。,剪接位点是通用的；剪接器无组织特异性。,7,exon-trapping,8,内含子切除存在优先途径,原初转录物,缺少内含子5、6,缺少内含子4、5、6、7,只有内含子3,mRNA,9,剪接的第一步，是内含子5 端与上游外显子之间断裂；5端与内含子中靠近3端的一A 残基2-OH 形成一索套形中间产物;A 所在位点称为分支位点（branch site）;第二步，在3位点切割，释放出内含子，连接两个外显子。,索套（lariat）结构,10,两步反应都通过酯基转移（transesterificat

4、ion）进行,分支位点A残基2-OH攻击5位点,上游外显子3-OH攻击3位点,11,（二）剪接体（spliceosome）,剪接器含蛋白与核内小RNA，称为snRNA（核内小RNA，small nuclear RNA），大小为100300（高等真核生物）或者1001000（yeast）.以核蛋白形式存在。该核蛋白称为snRNPs.scRNA（胞质内小RNA，small cytoplasmic RNA），其形成的核蛋白称为scRNPs.snoRNA（核仁小RNA，small nucleolus RNA）：参与rRNA加工。,12,snRNP与其它蛋白形成剪接体（spliceosome）。参与剪接

5、的snRNA都很保守，参与剪接的snRNA为U1,U2,U4,U5,U6。每个snRNP含一个snRNA和多个蛋白，其结构核心都有一组8个蛋白。除U6 外，都含有保守序列PuAU3-6GPu。snRNA的功能：参与核蛋白复合体的结构构建；通过与靶位点RNA或在snRNA之间的碱基配对来执行剪接功能。,13,U1 snRNA可直接与内含子5位点配对，这是为剪接所必须的。,14,剪接体的组装和剪接过程,E 复合体,A 复合体,B1 复合体,B2 复合体,C1 复合体,C2 复合体,15,5 of Intron 剪切与lariat 的形成同步,3 of intron 剪切与lariat 切除，exo

6、ns连接同步,spliceosome 解体与lariat降解同步,Cut-ligate,16,U6与U4、U2通过碱基配对相互作用,由于U4 和U2 都是通过与U6的同一段碱基序列互补配对进行作用，因此 U6/U4 和 U6/U2 不能相容。,17,二、自我剪接的RNA,核酶（ribozyme）：通指具有催化活性的RNA。核酶P是一核蛋白，只一条与蛋白结合的RNA。RNA具有催化tRNA切割的功能；而蛋白的功能是间接的，可能是维持RNA的结构。拟病毒类小RNA可进行自切割反应。尽管是分子内反应，也可分为催化部分和底物部分。I 类和 II 类内含子具有把自己从前体mRNA中剪接出的能力。,Tho

7、mas Cech,Nobel prize in 1989,18,一类内含子（Group I）,35S RNA在体外可自发剪接，内含子剪下为线型，然后进一步环化。,这一反应只需一种二价阳离子和鸟苷酸（GNP）；GNP必须具自由3-OH。,出现于低等真核生物四膜虫核内编码rRNA的基因。在真菌线粒体中很普遍。也存在于噬菌体T4和细菌中。这类内含子具有自我剪接（self-splicing/autosplicing）的能力。,19,GNP的3-OH攻击内含子5端，形成G-内含子，和外显子部分；分离的外显子3-OH攻击下一个外显子的5端；释放的内含子3-OH攻击自身5端15碱基处。,反应通过三步酯基转移

8、反应进行。,20,21,线型L19 RNA可催化寡聚胞苷酸（C5）延长,22,具有9个配对区（双螺旋区），其中P4、P7比较保守；P3、P4、P6、P7形成内含子的“核心”，是可进行具催化反应的最小区域；P1包括一段外显子，称为IGS（internal guide sequence）。,I 类内含子的一般二级结构,23,II 类内含子的domain5和domain6的结构，类似于和核RNA内含子剪接体中U6-U2及U2-内含子配对形成的结构。,(II 类内含子),(核RNA内含子剪接体),二类（group II）内含子的剪接,24,三类内含子剪接模式的比较,核RNA内含子和II类内含子的剪接很

9、相似：靠近3剪接位点的一A的2-OH 攻击内含子5末端，形成索套（lariat）中间体。,都是通过酯基转移反应进行；,25,三、酵母tRNA的剪接,前面的剪接反应是依赖于一些短的保守序列，转酯反应与连接反应同时进行。在酵母tRNA的剪接过程中，采用了不同的机制，链的断裂与连接是两个独立的反应。,26,tRNA 的剪接与成熟（真核生物）,27,pP,28,四、RNA的末端修饰,（一）mRNA的5端修饰,1、加帽,在磷酸酶的作用下，将5-端的磷酸基水解，然后再加上鸟苷三磷酸，形成GpppN的结构，再对G进行甲基化。新加的G以反方向与5连接，这一结构称为帽子（cap）结构,5 5 Gppp+pppA

10、pNpNp.5 5 GpppApNpNp.+pp+p,29,2、甲基化,只在末端G的7位甲基化的帽子称为帽子0（cap 0），写作m7GpppX；,若第二个核苷酸2-OH甲基化，则称为帽子1（cap 1），写作m7GpppXm；,若第三个核苷酸2-OH甲基化，则称为帽子2（cap 2），写作m7GpppXmpYm。,30,mRNA 3末端的产生,Pol I 和pol III 在特定的位点终止合成,（二）RNA的3末端修饰,Pol II无特定终止位点？,31,Pol II无特定终止位点，3-OH末端通过在特定位点切割后加上poly(A)来形成。末端的AAUAAA序列作为切割和添加poly(A)的

11、位点的信号。,32,产生正确的末端结构需要核酸内切酶（由CFI和CFII组成）切割RNA；特异组分（CPSF）识别AAUAAA序列；激发因子CstF，结合在切割位点下游一富含G-U的序列。poly(A)聚合酶（PAP）合成poly(A)尾部；,33,酵母中rRNA的一般加工过程,rRNA 的切割,真核rRNA 前体包括18S,5.8S,28S rRNA；前体rRNA在高等真核生物中为45S RNA，低等真核生物（酵母）中为35S RNA。成熟rRNA通过对前前体rRNA的切割和修剪（trimming）反应形成。,五、rRNA的加工,34,细菌rRNA基因中还常包含有12个tRNA基因,The

12、rrn operons contain genes for both rRNA and tRNA.,35,脊椎动物rRNA有大量的甲基化位点，位于保守位置；大多数snoRNA含有与18S、28S RNA甲基化位点互补的序列；碱基配对形成的双螺旋结构可为甲基化酶所识别。,36,酵母rRNA 中假尿苷的合成,37,五、RNA 编辑,RNA 编辑（RNA editing）是指在RNA水平改变遗传信息的加工。在哺乳动物细胞中，有时mRNA的单个碱基可被替代，从而改变编码的蛋白序列。在锥虫线粒体中，几个基因中可被系统地添加或删除。,38,载脂蛋白B（apo-lipoprotein B,apoB）基因在动物肝脏和小肠中的表达。C U转变通过脱氨反应进行，由脱氨酶催化。,39,细胞色素氧化酶II蛋白的序列与其基因相比，发生了移码（frameshift）。移码是通过在移码位点附近插入4个U形成。,40,T.brucei 的coxIII gene 在转录后大规模的RNA 编辑:插入大量碱基U，也删除了部分碱基U。,41,利什曼原虫（Leishmania）的细胞色素 b 基因表达时的RNA编辑,指导RNA（guide RNA）参与U的插入,42,U-OH,U,U,U,U,P,U,U,U,U,U,OH,U-OH,U,U,U,U,寡聚U的添加,