第5章表达载体.ppt

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1、1,第五章 表达载体,第一节 大肠杆菌表达载体 第二节 穿梭载体第三节 整合载体,2,一、大肠杆菌表达载体的结构原核表达载体：适用于在原核细胞中表达外源基因的载体。均是质粒载体，首先必然满足克隆载体的基本要求，然后增加表达元件。1、表达元件(expression elements)：1）启动子(promoter)：三类，即lac启动子、trp启动子和它们的杂合启动子tac或trc，都受IPTG诱导。T7噬菌体启动子噬菌体的PL启动子。,第一节 大肠杆菌表达载体,3,2）终止子：依赖于因子或不依赖于因子（遇茎环结构而终止）。3）核糖体结合位点(ribosome binding side,RBS)

2、：Shine-Dalgarno(SD)序列，ATG与RBS之间的距离很重要，一般3-11bp。2、表达形式完整单一蛋白：单一基因的编码区表达。融合蛋白(fusion protein)：多个基因的编码区的串联体，但构成一个整体的单一ORF，如果融合标签蛋白有利于蛋白的定向、纯化，如果融合多个目标蛋白，则类似于直接表达了一个多酶复合体一样，可减少载体构建难度，而且可以偶连两个或多个相关基因的表达。,4,3、表达的控制诱导表达系统：IPTG防渗漏表达系统：lacIqPL启动子受c的调控，低温(30)下阻抑转录，高温(40-45)下解除抑制。二、利用T7噬菌体启动子的表达载体pET系列，表达能力强，可

3、控性好，只受T7噬菌体RNA聚合酶识别，不受大肠杆菌RNA聚合酶识别，可用IPTG诱导表达。,5,非融合型表达载体 主要元件：强启动子、SD、起始密码子ATG、万能终止密码子。,P,SD,Foreign DNA,非融合型表达载体,非融合基因,6,非融合型表达载体-pPL-Lamda,PL启动子-温度诱导插入位点-HpaI,7,三、表达融合蛋白的表达载体1、GST(glutahione S-transferase,谷胱苷肽S-转移酶)表达载体：如Amershamm公司的pGEX系列，其GST来自于血吸早虫，融合蛋白下保持酶学活性，对谷胱苷肽有很强的结合能力，融合蛋白纯化出来后用凝血蛋白酶切割可得

4、到纯的目的蛋白。2、组氨酸标签表达载体：如Novagen公司的pET系列，可在目标蛋白的N-端或C-端加上6个组氨酸的标签和Xa因子酶工位点，能与镍等二价金属离子结合，纯化目的蛋白，用Xa因子处理可得到纯的目的蛋白。,8,3、内含肽表达载体：如NEB公司的Impact-Twin系统，将目的蛋白放在两个可自裂解的内含肽(intein)中间，在得到融合蛋白以后不通过蛋白酶消解、只需要调节pH值等条件就将标签蛋白切除。4、分泌表达载体：产物可跨膜分泌至胞周间隙，可避免受细胞内蛋白酶的降解，或使其正确折叠，或去除N-端甲硫氨酸，以维护活性。信号肽(signal peptide)有碱性磷酸酶信号肽、蛋白

5、质A信号肽（如Amersham公司的pEZZ18系统）。,9,融合型表达载体,P,SD,Foreign DNA,融合型表达载体,融合基因,10,技术关键：克隆基因可插入标签肽序列的3或5端，但必须维持正确的ORF。选择合适酶切位点加人工合成的DNA接头构建位相载体,11,-ATG-AAC CTG GAA TTC CTA GGT-TAC-TTG GAC CTT AAG GAT CCA-,EcoRI,BamHI,AAT CGG AAG AAT TCA GAC CTA GGTTTA GCC TTC TTA AGT CTG GCT CCA,载体部分序列,DNA序列,12,位相载体-含有3种读码框的系列

6、载体,13,优点：表达效率高产物稳定 易鉴定：融合蛋白分子量大，电泳可鉴定易纯化：利用融合原核多肽的特性,14,Ptac：IPTG诱导GST融合蛋白直接纯化产物，切割方便：pGEX-1T凝血酶 pGEX-2T-凝血酶 pGEX-3T-X因子位相载体,融合型载体-pGEX系列,15,分泌型融合表达载体-pEZZ18,16,分泌型表达载体-pINIII-ompA1,17,四、表达产物的纯化1、包涵体(inclusion body)的纯化：许多情况下表达产物在细胞内形成不溶的颗粒状包涵体，可通过机械法、冻融法、超声波处理等破碎细胞，离心收集包涵体，洗涤去除杂蛋白，用盐酸胍、尿素和SDS溶解包涵体，再

7、通过一定的法使蛋白质折叠。有的经上法得到后仍然有活性，有的蛋白一旦形成包涵体后就没有活性了，但可作为抗原。2、可溶性蛋白的纯化：表达的蛋白可以细胞内呈可溶状态，也有少量进入细胞周质区。将细胞裂解物的上清部分用于纯化目标蛋白，甚至可直接作为粗酶液进行生化反应。,18,穿梭载体(shuttle vector)：能够在两类不同的宿主中复制、增殖和选择的载体，主要是质粒，它们至少有两套复制单元和两套选择标记，相当于两个载体的联合。只要涉及大肠杆菌以外的细胞，绝大多数载体都装有大肠杆菌质粒载体的基本元件，都可看作穿梭载体。,第二节 穿梭载体,19,一、大肠杆菌/革兰氏阳性菌穿梭载体：如向枯草芽孢杆菌的穿

8、梭。二、大肠杆菌/酵母菌穿梭载体：主要用于遗传学和真核表达研究，尤其是当蛋白需要进行真核修饰时，如磷酸化、糖基化等。三、其它穿梭载体：如动物病毒载体、植物转化的Ti质粒、昆虫杆状病毒等，更为复杂一些。,20,21,整合载体(integration vector)：用于将某个基因或某些基因插入到宿主的染色体中去工作，按整合方式可分为定点整合和随机整合两类，按作用可分为目的基因的插入/敲除或随机突变体库的构建。一、基因插入/基因敲除同源重组整合载体最为常用，不仅含有大肠杆菌克隆载体的骨架，还有一段便于同源重组的重组DNA片段。,第三节 整合载体,22,二、随机插入突变载体用于功能基因组研究中基因突

9、变材料的创造。随机突变体库是指标记基因在载体的携带下通过DNA重组事件随机插入到基因组中而形成的众多基因突变体的集合。1、微生物插入突变体库：如pEG922，需要借助转座子。2、构建植物突变体库所用的载体：根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的T-DNA插入或植物转座子(transposon)标签是植物基因功能研究中常用的产生突变体的方法,23,1）T-DNA插入突变体：植物转基因过程中T-DNA区段如果插入到一个功能基因中，会导致该基因插入失活而产生性状变化，形成突变体。还可以在T-DNA区段构建基因激活标签、基因陷阱(gene trap)、启动子陷阱(pro

10、moter trap)或增强子陷阱(enhancer trap)，用于直接克隆靶基因编码区、启动子、增强子等。对于突变基因，只需要采用反向PCR或锚定PCR扩增或通过筛选文库，就可以直接克隆得到其序列。,24,2）植物Ac-Ds转座子双因子插入突变：玉米Ac(activator)因子是一个转座子，含有完整的转座酶，Ds(dissociation)是Ac缺失转座酶基因的缺失体，但具两端的反向重复序列。分别构建含Ac和Ds的质粒载体载体并分别转化植物，转基因植株杂交(AcDs)后代中会发生转座事件而产生突变体。利用Ac-Ds序列作探针或引物克隆目标基因。,25,3）构建动物随机突变体库常用载体：用基因陷阱。基因陷阱的基本原理是通过携带有报告基因的载体随机整合到动物或其它生物染色体，干扰内源基因的功能，并标记被插入的基因，然后克隆之，方法同前面的植物的方法一样。动物的转化方法与植物不同，一般采用电转化、反转录病毒转染等。,