第6章基因操作中大分子的分离和分析.ppt

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1、第 六 章 基因操作中大分子的分离和分析,第一节 DNA的分离、检测和纯化第二节 RNA的分离、检测和纯化第三节 分子杂交第四节 RNA作图和端点分析第五节 重组DNA分子导入大肠杆菌,第一节 DNA的分离、检测和纯化,一、大肠杆菌质粒DNA的分离和纯化二、DNA的琼脂糖凝胶电泳三、聚丙烯酰胺凝胶电泳四、脉冲场凝胶电泳五、DNA片段的纯化,天然DNA来源:染色体DNA。病毒和噬菌体DNA。质粒DNA。线粒体和叶绿体DNA。,一、大肠杆菌质粒DNA的分离和纯化,分离质粒DNA的方法众多，其依据是利用分子大小不同、碱基组成的差异以及质粒DNA的超螺旋共价闭合环状结构的特点来进行分离。目前常用的有碱

2、裂解法、煮沸法、去污剂(如Triton或SDS)裂解法、羧基磷灰石柱层析法、质粒DNA释放法、酸酚法等。,1 碱裂解法提取大肠杆菌质粒DNA原理,碱裂解法由Birnboim和Doly设计并于1979年发表，基于染色体DNA与质粒DNA变性与复性的差异而达到分离目的。在pH高达12.5的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性，质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离。,当以pH4.6的KAc高盐缓冲液调节其pH至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构。通过离心，染色体DNA与不稳定的大

3、分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。,大肠杆菌质粒DNA的提取步骤,pET28c(+)电泳结果,碱抽提法所用试剂的生化作用,提取过程中所用的材料有LB培养基、葡萄糖/Tris/EDTA溶液(5Ommol/L葡萄糖；25mmol/L TrisHCl；pH8.0，lOmmol/L EDTA)、TE缓冲液、3mol/L乙酸钾溶液、NaOH-SDS溶液、溶菌酶液、异丙醇、100%乙醇和70%乙醇等。,溶菌酶:溶菌酶是糖苷水解酶，水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的-1，4糖苷键，因而具有溶菌作用。葡萄糖:葡萄糖增加溶液粘度，维持渗透压，防止DNA受机械剪切力作用而降解。EDTA:

4、EDTA螯合Mg2+和Ca2+等金属离子，抑制脱氧核糖核酸酶对DNA的降解作用,同时有利于溶菌酶的作用。,NaOH-SDS液:NaOH浓度为0.2 mol/L，加抽提液时，该系统的pH就高达12.6，因而促使染色体DNA与质粒DNA的变性。SDS是离子型表面活性剂，它可以溶解细胞膜上的脂质与蛋白，因溶解膜蛋白而破坏细胞膜、解聚细胞中的核蛋白，还能与蛋白质结合成为R-O-S03-R+一蛋白质的复合物,使蛋白质变性沉淀下来。,KAc:pH4.8的KAc溶液是为了把pHl2.6的抽提液调节至中性，使变性的质粒DNA能够复性，并能稳定存在。高盐3mol/L KAc有利于变性的大分子染色体DNA、RNA

5、以及SDS-蛋白复合物的凝聚而沉淀。染色体DNA因为中和了核酸上的电荷，减少相斥力而互相聚合，钾盐与RNA、SDS-蛋白复合物作用后，形成钾盐形式复合物，使沉淀更完全。,无水乙醇:沉淀DNA，它的优点是可以任意比例和水相混溶，且乙醇与核酸不会起任何化学反应，对DNA很安全。DNA溶液是DNA以水合状态稳定存在，当加入乙醇时，乙醇会夺去DNA周围的水分子，使DNA失水而易于聚合。,酚-氯仿:酚与氯仿是非极性分子，水是极性分子，当蛋白水溶液与酚或氯仿混合时，蛋白质分子之间的水分子就被酚或氯仿挤去，使蛋白质失去水合状态而变性。经过离心，变性蛋白质的密度比水的密度大，因而与水相分离，沉淀在水相下面，从

6、而与溶解在水相中的DNA分开。而酚与氯仿有机溶剂比重更大，保留在最下层。,异戊醇:异戊醇能降低分子表面张力，能减少抽提过程中泡沫的产生。同时异戊醇有助于分相，使离心后的上层水相、中层变性蛋白相以及下层有机溶剂相维持稳定。,2023/11/7,16,2 通过试剂盒分离纯化大肠杆菌质粒DNA,二、DNA的琼脂糖凝胶电泳,1、凝胶电泳的基本原理一种分子被放置到电场中，它就会以一定的速度移向适当的电极。它与电场强度和电泳分子本身所携带的净电荷数成正比。就是说，电场强度越大，电泳分子所携带的净电荷数量越多，其迁移的速度越快，反之则较慢。电泳分子在电场作用下的迁移速度，叫做电泳迁移率。,2、影响电泳迁移速

7、率的因素：1）分子筛效应DNA分子在凝胶介质中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖一磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型。,2）相对分子质量具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样，可进行分离。DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。DNA样品与已知相对分子质量大小的标准DNA片段进行电泳对照，观察其迁移距离，就可获知该样品的相对分子质量大小。凝胶电泳不

8、仅可以分离不同相对分子质量的DNA，也可以鉴别相对分子质量相同但构型不同的DNA分子。,3）构型在抽提质粒DNA过程中，由于各种因素的影响，使超螺旋(SC)的共价闭合环状(CCC)结构的质粒DNA的一条链断裂，变成开环状(OC)分子，如果两条链发生断裂，就转变为线状(L)分子。这3种构型的分子有不同的迁移率。在一般情况下，超螺旋型分子迁移速度最快，其次为线状分子，最慢的为开环状分子。当提取到的质粒DNA样品中还有染色体DNA或RNA时，在凝胶电泳上也可以分别观察到电泳区带，由此可分析样品的纯度。,3、DNA的琼脂糖凝胶电泳1）DNA的显示原理：制备琼脂糖凝胶时加入溴化乙锭指示剂，溴化乙锭(EB

9、)在紫外光照射下能发射桔红色的荧光。当DNA样品在琼脂糖凝胶中电泳时，琼脂糖凝胶中的EB就插入DNA分子中形成荧光络合物，使DNA发射的荧光增强几十倍。荧光的强度正比于DNA的含量，如将已知浓度的标准样品作琼脂糖凝胶电泳对照，就可比较出待测样品的浓度。若用薄层分析扫描仪检测，只需要5lOng DNA，就可以从照片上比较鉴别。如用肉眼观察，可检测到0.010.1g的DNA。,2）影响电泳迁移的主要因素：DNA的大小DNA的构象琼脂糖浓度缓冲液：乙酸盐缓冲液(TAE)、硼酸盐缓冲液(TBE)、磷酸盐缓冲液(TPE)。,不同构像质粒,分离不同大小DNA片段的合适琼脂糖凝胶浓度,3）琼脂糖凝胶电泳的操

10、作过程,A、缓冲液制备B、EB母液配制：10mg/ml，在4下保存C、将点样梳洗净干燥放入胶板中D、琼脂糖胶板的制备：称量加入三角瓶一定的琼脂糖粉末，按所需凝胶浓度加入适量体积的缓冲液，将三角瓶塞口，微波炉中融化。融化好后冷却到60左右，加入EB溶液，至最终浓度为0.5ug/ml。摇匀倒入放置好的点样梳的胶板中，排走气泡。室温放置30-45min。,3）琼脂糖凝胶电泳的操作过程,E、加样和电泳：将胶板放入电泳槽，注入缓冲液，使液面高于胶面1-2mm，排出加样孔内的气泡，用微量移液枪加入DNA样品。接通电源，调好电压和电泳时间。可根据溴酚兰的位置结束电泳，关闭电源。F、取出凝胶，置于紫外投射仪上

11、，调好相机焦距拍照,3）琼脂糖凝胶电泳的操作过程,紫外线光源灵敏度:302nm254nm366nm,三、聚丙烯酰胺凝胶电泳特点：分辨率高适于寡聚核苷酸及DNA序列分析，DNA500bp载样量大回收DNA纯度高,四、脉冲场凝胶电泳(pulsed-field gel electrophoresis PFGE)与常规的直流单向电场凝胶电泳不同，这项技术采用定时改变电场方向的交变电源，每次电流方向改变后持续1秒到5分钟左右，然后再改变电流方向，反复循环，所以称之为脉冲式交变电场。,+,+,+,-,-,-,-,-,2,五、DNA片段的纯化,根据实验要求不同，有时需要高纯度的DNA，对提取的DNA样品须进

12、一步纯化并除去溴化乙锭(EB)。常用的DNA纯化方法有：低熔点琼脂糖凝胶电泳法、透析袋电洗脱法、氯化铯-溴化乙锭连续梯度离心法、离子交换层析法、“基因纯”试剂纯化等。,透析袋电洗脱法,适用于小剂量DNA纯化和酶切DNA片段回收。DNA样品在琼脂糖凝胶电泳分带。切取含待纯化DNA带的琼脂糖凝胶块，装入透析袋，进行电泳1-2h后，再反向电泳1-2min。吸取透析袋中的洗脱液于离心管中离心。转移上清液到另一离心管中，加入2倍体积无水乙醇混匀，于-20放置过夜沉淀后，离心后上清液，最后把沉淀物溶于TE缓冲液中，-20保存备用。,通过凝胶电泳回收的DNA样品和氯化铯-溴化乙锭连续梯度离心制备的DNA样品

13、，因检测需要而含有溴化乙锭(EB)，会影响限制性核酸内切酶的切割，因此有必要去掉插入到DNA中的EB，常采用的方法有：正丁醇(或异戊醇)抽提或Dowex树脂层析法等。,2023/11/7,41,韩国 MEGAquick-spin PCR 产物与胶回收试剂盒,DNA的浓缩,当提取的DNA溶液的浓度达不到实验要求时，必须进行DNA溶液的浓缩。实验室常用的方法有：乙醇沉淀法、正丁醇抽提法和聚乙二醇浓缩法等。,（四）DNA的定量和纯度测定,DNA样品的浓度的测定，一般采用紫外光谱分析、EB荧光分析、水平式琼脂糖凝胶电泳法、聚丙烯酰胺凝胶电泳法和脉冲电泳法等。,紫外光谱分析法,紫外光谱分析法的原理基于D

14、NA(或RNA)分子在260nmm处有特异的紫外吸收峰且吸收强度与系统中DNA或RNA的浓度成正比。分子形状、双链与单链之间的转换也会导致吸收水平的改变，但是这种偏差可以用特定的公式来校正。该法的特点是准确、简便，但所需仪器较昂贵。,衡量所提取DNA的纯度可用OD260与OD280的比值,OD260/OD280对DNA而言其值大约为1.8。当OD260/OD280大于1.8则可能有RNA污染。当OD260/OD280小于1.8时则有蛋白质污染。双链DNA的OD260为 1时相当于浓度为50g/mL。单链DNA的OD260为 1时相当于浓度为40g/mL。寡核酸的OD260为 1时相当于浓度为2

15、0-40g/mL。,EB荧光分析法,EB荧光染料能插入DNA或RNA的碱基对平面之间并结合在上面，在紫外光的激发下产生桔黄色荧光。由于结合于DNA分子之上的EB的量与DNA分子长度和数量成正比，则荧光强度可以表示DNA量的多少。,将标准DNA溶液按浓度由低到高分别与同样体积的EB溶液混匀在一块黑色的点样板上形成一个浓度梯度，然后将待测DNA也与同样体积的溴化乙锭混匀，最后将待测样品与标准品在紫外灯下发出的荧光强度进行比较，就能测出该样品总DNA浓度。EB是嫌疑性的致突变物质。,第二节 RNA的分离、检测和纯化,细胞中的核酸：DNA和RNA。RNA：rRNA、tRNA、mRNA。一个典型哺乳动物

16、细胞约含10-5g RNA。80%85%rRNA(28S、18S、5S rRNA)。15%20%低分子量RNA(如tRNA、核内小分子RNA等）。1%5%mRNA，一般按2%计算。,实验成败关键：创造一个无RNase的环境去除外源性RNase的污染：DEPC(焦碳酸二乙脂)抑制内源性RNase的活性Rase阻抑蛋白（Rasin，非竞争性抑制剂）氧铜核糖核苷复合物硅藻土,RNA的抽提与纯化,总RNA的制备真核生物mRNA的纯化从总RNA中，用寡聚(dT)亲和层析柱分离mRNA。可应用Promega PolyAT tract mRNA 分离系统分离多聚(A)mRNA。将用生物素标记的寡聚(dT)引

17、物与细胞总RNA共温育，加入与微磁球相连的抗生物素蛋白，用磁场吸附通过寡聚(dT)引物与抗生物素蛋白及强力微磁球相连的mRNA。,RNA的电泳检测,RNA的浓度和纯度可通过测试其OD260来判断，OD260为 1时相当于浓度为40g/mL。检测：琼脂糖凝胶电泳法、聚丙烯酰胺凝胶电泳法。,28S,18S,总RNA电泳条带,第三节 分子杂交,一、Southern杂交二、Northern杂交三、菌落原位杂交四、Western杂交,2023/11/7,55,分子杂交(molecule hybridization),分子杂交是指在分子克隆中的一类核酸和蛋白质分析方法，用已知标记的核酸分子或蛋白质分子检测

18、混合样品中未知核酸分子或蛋白质分子，以及其相对分子量大小。根据其检测对象的不同可分为 Southern 杂交、Northern 杂交和 Western 杂交，及由此简化的斑点杂交、狭线杂交和菌落杂交。,2023/11/7,56,分子杂交可在DNA与DNA、RNA与RNA或RNA与DNA的二条单链之间进行，也可能在蛋白质与蛋白质之间进行。核酸分子杂交是指核酸分子(DNA或RNA)在变性以后，在复性的过程中两个不同来源的且同源的核酸分子形成杂合双链的过程。通过各种方法将核酸分子固定在固相支持物上，然后用放射性标记的探针与被固定的分子杂交，经显影后显示出目的DNA或RNA分子所处的位置。,2023/

19、11/7,57,2023/11/7,58,一、Southern杂交 这种方法是E.M.Southern1975年建立,是进行基因组DNA特定序列定位的通用方法。,2023/11/7,59,（一）Southern杂交的操作步骤,1.预处理：（1）用限制性内切酶将基因组DNA进行酶切。（2）将酶切后的DNA片段进行琼脂糖凝胶电泳。（3）将电流出来的那块凝胶泡在强碱溶液中，此时双链的DNA样品变性成单链DNA结构。（4）用酸中和，使单链DNA维持其单链状态2.原位转移：将凝胶上的单链DNA转移到尼龙膜上。,2023/11/7,60,3.固定：在真空烤箱里，80下烤1-3h。将核酸样品进一步固定在滤膜

20、上4.杂交：杂交之前须有一个预杂交，封阻膜的背景，避免杂交时背景吸附探针。将滤膜移在含有放射性同位素标记的探针分子溶液中，溶液上的单链DNA分子与探针分子通过互补配对进行杂交，形成杂种分子。,2023/11/7,61,5.漂洗：将滤膜上没有和单链DNA样品结合的游离的探针分子漂洗下来，此后滤膜上只有杂交分子。6.放射自显影：在X光曝射下进行放射自显影形成自显影图片。7.比较鉴定：将放射自显影图片上的谱带与凝胶上的谱带进行比较。确定与探针分子结合的DNA分子是凝胶上DNA链的那个片段。,2023/11/7,62,2023/11/7,63,Southern Blotting的过程1.碱变性的琼脂糖

21、凝胶电泳分离的DNA2.通过电泳液的移动转移胶中的DNA3.固定胶中的DNA4.预杂交和杂交(放射性和荧光检测)5.结果检测,2023/11/7,64,Southern印迹杂交方法操作简单，结果十分灵敏，在理想的条件下，应用放射性同位素标记的特异性探针和放射自显影技术，即使每带电泳条带仅含有2ng的DNA也能被清晰地检测出来。,2023/11/7,65,1.硝酸纤维素滤膜 在印迹技术中，硝酸纤维素滤膜是目前应用最广的一种固相支持物，但它存在一些不足之处:（1）硝酸纤维素滤膜是依赖疏水性相互作用结合DNA的，这种结合并不十分牢固，随着杂交及洗膜进程，DNA会慢慢脱离硝酸纤维素滤膜，从而使杂交效率

22、下降。,（二）Southern杂交的杂交滤膜,2023/11/7,66,（2）硝酸纤维素滤膜质地较脆弱，容易碎裂，因此操作须小心谨慎(特别是经烘烤后)。（3）硝酸纤维素滤膜与核酸的结合有赖于高盐浓度，在低盐浓度时结合DNA效果不佳，不适宜于电转印迹法。（4）硝酸纤维素滤膜对于小分子质量的DNA片段(特别是小于200bp的DNA片段)结合能力不强。,2023/11/7,67,2.尼龙膜优点：结合DNA和RNA的能力强于硝酸纤维素滤膜，对小分子质量的核酸也能较好地结合。尼龙膜韧性强，操作较方便，对离子浓度要求不高，可重复用于杂交。缺点：杂交信号本底较硝酸纤维素滤膜高。,2023/11/7,68,将

23、RNA分子从电泳凝胶转移到硝酸纤维素滤膜或其他化学修饰的活性滤纸上，进行核酸杂交的一种实验方法。,二 Northern杂交,2023/11/7,69,Northern杂交的过程,提取总RNA。分离mRNA。利用亲和层析的原理纯化mRNA。制备RNA探针。根据mRNA序列合成同源DNA探针，或以cDNA为探针。Northern杂交。Northern杂交的方法包括点杂交和印迹杂交，两者都能鉴定外源基因是否得到转录，但后者还能确定mRNA分子质量大小及丰度。,2023/11/7,70,三 菌落原位杂交（colony in situ hybridization）,1975年，M.Grunstein和D

24、.Hosnese根据检测重组子DNA分子的核酸杂交技术原理,对Southern印迹技术作了一些修改,提出了菌落原位杂交技术。该项技术是直接把菌落印迹转移到硝酸纤维素滤膜上,经溶菌和变性处理后使DNA暴露出来并与滤膜原位结合,再与特异性DNA探针杂交,筛选出含有插入序列的菌落。,2023/11/7,71,菌落原位杂交的操作步骤,2023/11/7,72,2023/11/7,73,四 Western杂交,是将蛋白质电泳、印迹和免疫测定结合在一起的检测方法，具有很高的灵敏度，可从总蛋白中检测出50ng的特异性表达蛋白。,2023/11/7,74,Western杂交的操作步骤,2023/11/7,75

25、,Western Blot 检测HIV,2023/11/7,76,Southern印迹法(DNA印迹法,Southern blotting)：是一种把DNA电泳分离区带转移到支持膜上的技术。因这一技术是英国科学家E.M.Southern首先创建的，而且这一转移过程与墨迹被吸印到吸墨纸上的过程相似，所以用他的姓氏命名为Southern印迹法。Northern印迹法(RNA印迹法,Northern blotting)：Alwine等人将Southern印迹法应用于RNA，原理与Southern印迹法相似。Alwine等人根据命名Southern印迹法的姓氏中含有“南部”之意，风趣地把他们的RNA印

26、迹法称为“北部”印迹法（Northern blotting）。,2023/11/7,77,Western印迹法（蛋白质印迹法，Western blotting）：是一种从混合蛋白质中检出微量特定蛋白质的方法。人们把这种以电驱动为转移方式的蛋白质印迹法诙谐地称为“西部”印迹法（Western blotting）。Eastern印迹法（Eastern blotting）：也是一种蛋白质印迹法，与Western印迹法不同之处是：先用等电聚焦-聚丙烯酰胺凝胶电泳（IEF-PAGE）分离蛋白质，然后也是将蛋白质的分离区带、以电驱动转移方式进行了印迹。这一方法又被称为Eastern blotting。,2

27、023/11/7,78,一、RNA的S1核酸酶作图：分析原mRNA加工剪接为成熟mRNA中的剪切区段和边界。二、S1核酸酶作图分析mRNA端点：5和3端均可分析。三、引物延伸法分析mRNA的端点：只能用于5末端的作图。,第四节 RNA作图和端点分析,2023/11/7,79,2023/11/7,80,第五节 重组DNA分子导入受体细胞,一 选择受体细胞的基本原则二 重组质粒DNA转化大肠杆菌,2023/11/7,82,受体细胞(receptor cell)又称为宿主细胞或寄主细胞(host cell)等，从实验技术上讲是能摄取外源DNA并使其稳定维持的细胞;从实验目的上讲是有应用价值和理论研究

28、价值的细胞。感受态(competence)细胞处于能够吸收DNA的状态，称为感受态。感受态细胞(competent cell)处于能够吸收DNA状态的细胞。,2023/11/7,83,细菌转化，是指一种细菌菌株由于捕获了来自另一种细菌菌株的DNA，而导致性状特征发生遗传改变的生命过程。转化子(transformant)：经转化获得外源遗传物质的细胞。,2023/11/7,84,转化(transformation):指将质粒DNA或以它为载体构建的重组质粒导入细菌中的过程。转染(transfection):指病毒及其重组子导入受体细胞的过程。转导(transduction):指噬菌体及其重组子导

29、入受体细胞的过程。,2023/11/7,85,一 选择受体细胞的基本原则,1、便于重组DNA分子的导入。2、便于重组体的筛选。根据所用的表达载体所含的选择性标记与受体细胞基因是否相匹配，从而易于对重组体进行筛选。3、遗传稳定性高，易于进行扩大培养或易于进行高密度发酵而不影响外源基因的表达效率。对动物细胞而言，所选用的受体细胞具有对培养的适应性强，可以进行贴壁或悬浮培养，可以在无血清培养基中进行培养。,2023/11/7,86,4、受体细胞内内源蛋白水解酶基因缺失或蛋白酶含量低，利于外源蛋白表达产物在细胞内积累，可促进外源基因高效分泌表达。5、安全性高，无致病性，不会对外界环境造成生物污染。一般

30、选用致病缺陷型的细胞或营养缺陷型细胞作为受体细胞。,2023/11/7,87,6、能使重组DNA分子稳定存在于细胞中。从受体细胞的角度出发，通常的做法是是对其作适当的修饰改造，如选用某些限制性核酸内切酶缺陷型的受体细胞就可以避免其对重组DNA分子的降解破坏作用。7、受体细胞在遗传密码子的应用上无明显偏倚性。8、具有较好的转译后加工机制等，便于真核目的基因的高效表达。9、在理论研究和生产实践上有较高的应用价值。,2023/11/7,88,二 重组质粒DNA转化大肠杆菌,（一）氯化钙法 1970年M.Mandel和A.Hige发现,大肠杆菌经过氯化钙适当处理及短暂热休克之后,便能吸收噬菌体DNA。

31、1972年美国斯坦福大学 S.Cohen报道,经氯化钙处理大肠杆菌细胞也能摄取质粒DNA。,2023/11/7,89,原理是：细菌处于0和低渗氯化钙溶液中，菌细胞壁和膜通透性增加,菌体膨胀成球形，此时转化混合物中DNA形成抗DNase羟基-磷酸钙复合物粘附于细胞表面，经短暂热休克(42)后，细胞膜形成许多间隙，DNA进入细胞内。如果感受态细胞做得好，每微克超螺旋质粒DNA可得51071109个转化子。,2023/11/7,90,获得合格的感受态细胞，要注意以下几点：1、用作受体菌的细胞在培养时要掌握好细胞密度，一般在A600为0.5左右为好。2、制备受体细胞的整个过程在04进行,尽量避免污染。

32、如果用抗生素筛选转化子，作为对照受体菌应该在此培养基上不生长。3、为了提高转化率，可选用复合氯化钙溶液，如FSB溶液。,2023/11/7,91,2023/11/7,92,（二）电穿孔法,电穿孔法(electroporation):是指在一个较大的电脉冲短暂破坏细胞膜的脂质双层，从而允许DNA等分子通过细胞膜进入细胞，而后细胞膜快速复原，保持细胞的完整。这种方法称为电穿孔法。最早用于将DNA导入真核细胞，1988年，Dower等人成功应用于大肠杆菌的转化。其基本原理是利用高压电脉冲作用，在大肠杆菌细胞膜上进行电穿孔，形成可逆的瞬间通道，从而促进外源DNA的有效吸收。,2023/11/7,93,电穿孔转化法的效率受电场强度、电脉冲时间和外源DNA浓度等参数的影响，通过优化这些参数，每g DNA可以得到1091012转化子。电压增高或电脉冲时间延长时，转化效率将会有所提高，但同时导致受体细胞存活率的降低，转化效率的提高也因此被抵消。研究表明，当电场强度和脉冲时间的组合方式导致50%70%细菌死亡时，转化水平达到最高。,2023/11/7,94,