第7章蛋白质的分离、纯化和表征.ppt
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1、第7章蛋白质的分离、纯化和表征,Protein Separation,Purification and Characterization,因材施法,有的放矢,Protein Purification and Characterization,对蛋白质分子进行的各种研究,要建立在对蛋白质分子本身的性质(特别是区别于其它生物与化学分子的独特的性质)和各种实验手段的原理和适用性深入了解的基础上。,Protein Purification and Characterization,分离和纯化蛋白质的各种方法主要是利用蛋白质之间各种特性的差异,包括:分子的大小和形状酸碱性质溶解度吸附性质对配体分子的特异
2、生物学亲和力,Protein Purification and Characterization,The aim of protein purification is to isolate one particular protein from all the others in the starting material,exploits利用:Solubility Size Charge Hydrophobicity or/and specific binding affinity of the protein of interest,Protein Purification and Cha
3、racterization,.1 蛋白质的酸碱性质Ionization of protein对某一种蛋白质来说,在某一pH,它所带的正电荷和负电荷恰好相等,也即净电荷为零,这一pH称为蛋白质的等电点(isoelectric point,pI)。,沉淀技术,Ionization of protein,蛋白质的滴定曲线形状和等电点,在有中性盐存在下可以发生明显的变化。蛋白质等电点在一定程度上决定于介质中离子的组成。没有其他盐类干扰时,蛋白质质子供体基团解离出来的质子数与质子受体基团结合的质子数相等时的pH称为等离子点(isoionic point)。,acid excess positive ch
4、arge Cation exchanger,isoelectric pointbalanced positive and negative charge,alkalineexcess negative chargeAnion exchanger,3,10,pH,_,+,Overall charge on protein,The overall charge on a protein depends on pH,Ionization of protein,7.2 蛋白质分子的大小与形状Protein size and shape7.2.1 根据化学组成测定最低相对分子质量 铁的原子量铁的百分含量
5、=100 最低相对分子质量 铁的原子量最低相对分子质量=100铁的百分含量,55.8例如,肌红蛋白相对分子质量=100 0.335=16700 用其他物理化学法法测得的肌红蛋白Mr与此极为接近,可见肌红蛋白分子中只含一个铁原子。,Protein size and shape,7.2.2 渗透压法测定相对分子质量渗透与渗透压,渗透压法测定相对分子质量溶剂分子由纯溶剂(或稀溶液)向溶液(或浓溶液)单方向净移动现象称为渗透(osmosis)。渗透的结果,溶液内的体积增加,液面升高,直至达到一定的静水压力时维持平衡。这时的静水压力就是溶液在平衡浓度时的渗透压(osmotic pressure)。渗透压
6、是单位体积内溶质质点数的函数,而与溶质的性质和形状无关。,在浓度不大时,渗透压与溶质的相对分子量的关系为:=RT(c/Mr+K c2)Mr=RT/lim/c c0,渗透压法测定相对分子质量,7.2.3 蛋白质的扩散和扩散系数扩散(diffusion)dm/dt=-DA dc/dxD 扩散系数,A 扩散面积扩散系数随Mr的增加而降低。但扩散系数对Mr的变化并不敏感,一般不单独用来确定Mr。,7.2.4 沉降分析法测定相对分子质量蛋白质溶液在电场中受到强大的离心力作用时,如果蛋白质的密度大于溶液的密度,蛋白质分子就会沉降。沉降的速率与蛋白质分子大小和密度有关,而且与分子形状、溶液的密度和粘度有关。
7、沉降速率法沉降平衡法,沉降分析法测定相对分子质量,离心机转速 60 000-80 000rpm离心力 400 00-700 000g,沉降分析法测定相对分子质量,离心力 42 v 2 r F=-gF:离心力,单位以地心引力的倍数g表示(即g 或g)g:重力加速度,等于980.6 cm2/s2.r:通常指自离心管中轴底部内壁到离心转轴中心之间的距离(cm)v:为转速,即离心机每秒的转数,若以每分钟转数(rpm)表示,则上式应为 42 v 2 r F=-(1/60)2 g,7.2.4.1 沉降速率法沉降界面n单分子颗粒以恒定速度移动时,净离心力与摩擦力的关系:nFc-Fb=Ffn dx/dt mp
8、(1-)=2 f dx/dt s=2,单位离心场的沉积速度是个定值,称为沉降系数(sedimentation coefficient)或沉降常数。蛋白质、核酸、核糖体和病毒的沉降系数介于110-13 到20010-13 秒的范围。10-13 秒作为一个单位,斯维得贝格单位或沉降系数单位,即S。,沉降分析法测定相对分子质量,7.2.4.2 沉降平衡法利用沉降平衡法测定相对分子质量是在较低速度(8000-20000r/min)的离心场中进行的。蛋白质的沉降平衡(图7-3),沉降分析法测定相对分子质量,在时间dt内浓度为c的溶液越过横截面A的溶质量:dm=-cA dx/dt dt因此扩散作用沿相反方
9、向越过横截面A的溶质量:dm=-DA dc/dx dt,沉降分析法测定相对分子质量,当净离心力与扩散力平衡时,在离心池内从液面到液底形成一个由低到高的恒定浓度梯度,因此:2RTdln(c2/c1)Mr=(1-)2(x22-x12),沉降分析法测定相对分子质量,7.2.5 凝胶过滤法测定相对分子质量Gel filtration chromatography凝胶过滤法的原理,Gel filtration chromatography,Size exclusion chromatography Molecular sieve(筛子)chromatography Molecules are separ
10、ated on the basis of their size and shape.The protein sample in a small volumes is applied to the top of a column of porous(有孔的)beads that are made of an insoluble but highly hydrated(亲水的)polymer such as polyacrylamide(Bio-Gel)or the carbohydrates dextran(葡聚糖)(Sephadex)or agarose(琼脂糖)(Sepharose),Sma
11、ll molecules can enter the pores in the beads whereas larger or more elongated molecules cannot.The smaller molecules therefore have a larger volume of liquid accessible(可接近的)to them;both the liquid surrounding the porous heads and that inside the beads.,In contrast,the larger molecules have only th
12、e liquid surrounding the beads accessible to them,and thus move through the column faster,emerging out of the bottom(eluting洗脱)first.The smaller molecules move more slowly through the column and elute later.,层析柱的洗脱体积与分子量的关系:Ve=K1-K2lgM,凝胶过滤法测定相对分子质量,7.2.6 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定 相对分子质量SDS,有效变性剂,带负电荷巯基乙醇,打开二
13、硫键蛋白质亚基在电场中的行为只与分子大小有关。Rf=K1-K2 lg M,Electrophoresis of Protein,In polyacrylamide(聚丙烯酰胺)gel electrophoresis(PAGE)proteins are applied to a porous polyacrylamide gel and separated in an electric field on the basis of their net negative charge and their size.Small/more negatively-charged proteins migr
14、ate further through the gel than larger/less negatively-charged proteins,7.3 蛋白质的胶体性质 与蛋白质的沉淀Protein colloid character and deposition 7.3.1 蛋白质的胶体性质蛋白质溶液是一个分散系统分散相质点 100nm的为悬浊液,介于1-100nm的为胶体溶液。,Protein colloid character and deposition,胶体系统的稳定条件:1 分散相质点的大小2 分散相质点带有同种电荷3 分散相质点能与溶剂形成溶剂化层,每克蛋白质分子能结合0.3-
15、0.5克水。蛋白质溶液具有:丁达尔效应,布朗运动及 不能通过半透膜的性质。,Protein colloid character and deposition,The hydrophobic and hydrophilic parts on the surface of protein,Protein colloid character and deposition,7.3.2 蛋白质的沉淀沉淀蛋白质的方法:1)盐析法 盐析一般不引起蛋白质的变性2)有机溶剂沉淀法 脱去水化层及降低介电常数(酒精,丙酮)3)重金属盐沉淀法 生成不溶性的复合物4)生物碱试剂和某些酸类沉淀法 单宁酸,三氯醋酸,磺基水
16、杨酸和硝酸5)加热变性沉淀法,7.4 蛋白质分离纯化的一般原则Principles of Protein purification 蛋白质分离纯化的程序包括:1)前处理2)粗分级分离3)细分级分离4)结晶,7.5 蛋白质的分离纯化方法Methods of Protein Purification 根据蛋白质在溶液中性质的分离纯化方法:1)分子大小2)溶解度3)电荷4)吸附性质5)对配体分子的生物学亲和力,7.5.1 根据分子大小不同的纯化方法7.5.1.1 透析和超过滤常用的半透膜是玻璃纸或称赛璐玢纸。透析装置利用压力和离心力的超过滤装置,Methods of Protein Purifica
17、tion,Methods of Protein Purification,蛋白质的分离纯化方法,密度梯度(区带)离心法蛋白质颗粒的沉降不仅决定于它的大小,而且也决定于它的密度。,Methods of Protein Purification,Methods of Protein Purification,凝胶过滤 gel filtration chromatography,1903-1906,M.Tswett 将叶绿素的石油醚溶液通过CaCO3管柱,并继续以石油醚淋洗,由于CaCO3对叶绿素中各种色素的吸附能力不同,色素被逐渐分离,在管柱中出现了不同颜色的谱带,所以称色谱图。,Methods
18、of Protein Purification,Gel Filtration Chromatography也称:凝胶过滤层析分子排阻层析凝胶渗透层析分子筛层析凝胶的交联度和孔度(网孔大小)决定了凝胶的分离分级范围,Gel Filtration Chromatography,常使用的凝胶有:交联葡聚糖(Sephadex)聚丙烯酰胺凝胶(Bio-gel P)琼脂糖(Sepharose Bio-gel A),Gel Filtration Chromatography凝胶过滤的原理:当不同分子大小的蛋白质流经凝胶层析柱时,比凝胶孔径大的分子不能进入珠内网状结构,而被排阻在凝胶珠之外随着溶剂在凝胶珠之间
19、的空隙向下移动并最先流出柱外比网孔小的分子能不同程度地自由出入凝胶珠的内外这样由于不同大小分子所经过的路径不同而得到分离,凝胶过滤,柱层析的基本装置Column,蛋白质的分离纯化方法,层析柱通常是玻璃的。总的说来,长柱分辨率高。但大量物质的处理则用粗的柱比较适宜。,Column,蛋白质的分离纯化方法,凝胶过滤的术语:Vt 凝胶柱床的总(床)体积Ve 洗脱体积V0 孔隙体积,外水体积Vi 内水体积Vm 凝胶基质体积 Vt=Vi+V0+Vm,蛋白质的分离纯化方法,Gel Filtration Chromatography,7.5.2 利用溶解度差别的纯化方法7.5.2.1 等电点沉淀和pH控制,蛋
20、白质的分离纯化方法,利用溶解度差别的纯化方法,7.5.2.2 蛋白质的盐溶和盐析盐溶:少量盐促进蛋白质溶解的现象盐析:大量盐使得蛋白质沉淀的现象,盐析作用大量中性盐的加入使水的活度降低,原来溶液中的大部分甚至全部的自由水转变为盐离子的水化水那些被迫与蛋白质表面的疏水基团接触并掩盖它们的水分子成为下一步最自由地可利用的水分子,因此被移去以溶剂化盐离子,留下暴露出来的疏水基团随着盐浓度的增加,蛋白质疏水表面进一步暴露,由于疏水作用蛋白质聚集而沉淀最先聚集的蛋白质是表面上疏水残基最多的蛋白质。,蛋白质的分离纯化方法,利用溶解度差别的纯化方法,7.5.2.3 有机溶剂分级分离法与水互溶的有机溶剂(如甲
21、醇,乙醇和丙酮等)能使蛋白质在水中的溶解度显著降低。室温下,有机溶剂不仅能引起蛋白质沉淀,而且伴随着变性。控制有机溶剂浓度也可以分离纯化蛋白质。有机溶剂引起蛋白质沉淀的主要原因之一是改变了介质的介电常数。介电常数的降低将增加两个相反电荷之间的引力。,蛋白质的分离纯化方法,利用溶解度差别的纯化方法,7.5.2.4 温度对蛋白质溶解度的影响在一定温度范围内,约 0-40 之间,大部分球状蛋白的溶解度随温度升高而增加。人的血红蛋白从0-25,溶解度随温度上升而上升。,蛋白质的分离纯化方法,利用溶解度差别的纯化方法,脲或盐酸胍的变性作用,7.5.3 根据电荷不同的纯化方法7.5.3.1 电泳 Elec
22、trophoresis 在外电场作用下,带电颗粒,如不处于等电点的蛋白质分子,将向着与其电性相反的电极移动,这种现象称为电泳,蛋白质的分离纯化方法,Electrophoresis,区带电泳(zone electrophoresis)可分四类:a 滤纸电泳和薄膜电泳;b 粉末电泳;c 细丝电泳;d 凝胶电泳,适于分离蛋白质和多核苷酸、核 酸。,电泳装置主要包括两个部分:电源(电泳仪)和电泳槽。电源提供直流电,在电泳槽中产生电场,驱动带电分子的迁移。,Electrophoresis,蛋白质的分离纯化方法,蛋白质的分离纯化方法,Electrophoresis,7.5.3.2 聚丙烯酰胺凝胶电泳Pol
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