第7讲植物细胞培养生产代谢产物II.ppt
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1、第7讲,植物细胞培养制备代谢产物II,本节主要内容:,1.植物细胞培养生产次级代谢产物的技术方法2 2.植物细胞培养生产次级代谢产物的讨论,本节关键问题:,影响植物细胞培养生产次级代谢产物的因素及调控方法,一 代谢产物,初级代谢产物(Primary metabolites):是通过初级代谢产生的维持细胞生命活动必需的物质,如氨基酸、核苷酸、多糖、脂类等。在不同种类的细胞中,初级代谢产物的种类基本相同。初级代谢产物的合成无时无刻都在进行着,任何一种产物的合成发生障碍都会影响细胞正常的生命活动,甚至导致死亡。,次级代谢产物(Secondary metabolites)是通过次级代谢合成的产物,大多
2、是分子结构比较复杂的小分子化合物,例如抗生素、激素、生物碱、毒素等。由于次级代谢产物大多具有生物活性,因此是植物代谢产物研究的重点。,二 植物细胞培养生产代谢产物的意义一个例子:紫杉醇,紫杉醇(Taxol)是从红豆杉属植物中分离得到的一种双萜类化合物化。C47H51NO14,分子量:853.90用途:具有良好的抗癌活性,尤其对晚期、转移性卵巢癌、乳腺癌、肺癌有十分显著的疗效。制备途径:1.直接从红豆杉中提取2.化学全合成;化学半合成3.植物细胞培养4.内生真菌培养,提取:在不同红豆杉属植物树种和树木的不同部位(如树皮、木材、树叶、嫩枝和幼苗等)含量有所不同,以树皮、嫩芽中含量最高,心材最低。一
3、般含量为0.005%左右。生产1kg紫杉醇需要砍伐60年生大树3000-4000棵。若光从树皮中提取紫杉醇,每年需砍伐150-200万棵左右的大树。无法满足市场需求,破坏宝贵资源、不可持续发展。,化学合成:结构复杂,全合成需要几十步合成步骤,总得率,仅4-5%。成本高。,有效途径:红豆杉细胞培养制备紫杉醇,1.从树叶获取细胞,利于资源保护(红豆杉属于濒危保护植物)。2.细胞培养不受地理环境影响:地理环境、病虫害和季节等因素的影响,可以保证产物无限、连续、均匀地生产。3.利用生物技术提高目标产物含量,实现大规模培养制备。(1)可以通过进行红豆杉细胞的筛选,获得超过原植株紫杉醇含量的细胞。(2)易
4、于在生物反应器中满足最佳条件,进行大规模、高密度地培养。(3)可以进行红豆杉细胞紫杉醇代谢途径研究,利用代谢调控使细胞定向合成有用次生代谢物。,紫草素:为植物色素之一种(萘醌)。存在紫草植物中。抗癌、抗炎、抗菌等。日本在1983年用大规模紫草细胞培养来生产紫草素。,灵芝酸:是灵芝中除多糖外另一类具有广泛生理活性的物质,被证明具有止痛、镇静、抑制组织胺释放、解毒、保肝、抗肿瘤等活性。,人参皂苷:对人体神经系统、循环系统、血液系统等具有广泛的生物活性。,三 植物细胞培养生产次级代谢产物,(一)细胞株筛选,细胞系(Cell line)是由原代培养经传代培养纯化,获得的以一种细胞为主的、能在体外长期生
5、存的不均一的细胞群体。,细胞株(Cell strain)是指从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培养或通过筛选的方法,由单细胞增殖形成的细胞群。再由原细胞株进一步分离培养出与原株性状不同的细胞群,亦可称之为亚株(Substrain)。,细胞株和细胞系的区别,1 名词的由来:细胞株(cell strain)最初为W.Earle(1940)所采用,他把自己建立的小鼠结缔组织L系称为“株”。1951年,George Gey把其建立的人体宫颈癌细胞Hela系称为“株”1954年,White另外使用了“系”来称呼A Carrel培养的鸡胚心脏的细胞群,2 名词使用的现实情况21 中学教材定义在人教版
6、高中生物(选修)全一册第70页中,细胞株被定义为经原代培养的组织细胞,培养到第10代左右,度过第一次死亡危机后的细胞群,这种细胞的遗传物质没有发生改变;细胞系则被定义为可以度过第二次死亡危机,传代培养到4050代的细胞,这部分细胞的遗传物质发生了部分改变并且细胞带有癌变的特点,这种细胞在适宜条件下无限传代。,22 文献定义由新鲜组织制成的细胞培养物称原代细胞,这种细胞经首次传代成功后的细胞称做细胞系,可泛指一般可能传代的细胞。若用胰蛋白酶等将原代细胞消解分散后,再培养一代,称次代培养。如果不能继续传代或传代有限,可称为“有限细胞系(finite cell line)”或“已建立的细胞系(est
7、ablished line)”。能够连续传代的细胞叫做“连续细胞系或无限细胞系(infinite cell line)”。从一个经过生物学鉴定的细胞系或原代培养物用单细胞分离培养或通过筛选的方法,克隆具有特殊性质或标志的单细胞获得的细胞群,称细胞株。,3 比较不同观点得出的结论31 矛盾性:人教版高中生物教材中细胞株和细胞系的概念内涵与文献中的概念内涵不同甚至完全相反。人教版高中生物细胞株概念强调结束原代培养并可以进行传代培养的细胞群,并不强调细胞群的纯度;文献中的细胞株概念强调细胞群的纯度,认为细胞株是克隆的结果。人教版高中生物细胞系概念强调这些细胞已发生部分遗传物质的改变,带有癌变的可以传
8、代培养的细胞群;文献中的细胞系概念强调细胞系是首次传代成功后的细胞群。,32 划分标准人教版高中生物细胞系和细胞株定义以传代代数为标志区分,以遗传物质是否改变为标志;专业文献中这两个概念与传代代数无关,遗传物质的改变与否并不做要求。细胞株强调细胞培养物中细胞成分单一性,所有的遗传、生化等特性完全相同;细胞系不强调纯度,但应该有某一类细胞占绝大数。,细胞株指标,(1)分散性好,适合大规模悬浮培养。,(2)均一性好,细胞大小、生理状态一致。(3)生长速度快,培养周期短,不易染菌。(4)目标产物含量高,容易分离提取。(5)细胞遗传稳定。,适合工业生产用细胞株的一般筛选流程,1.愈伤组织的诱导与培养:
9、选用植物的目标化合物高产部位作为外植体诱导愈伤组织。愈伤组织形成后,进行继代培养。,2.单细胞分离:选取生长快速而疏松的愈伤组织,通过固体,培养基继代培养,挑选生长快速的细胞。,3.细胞无性系的分离:转移到液体培养基中进行悬浮培养,,从中选择分散性好、生长速度快的细胞。,4.细胞株筛选:检测目标产物含量,从(3)中选择目标产,物含量高的细胞株。,5.性能评价:进行较大规模培养,考察细胞生长与目标产物,合成的稳定性。,6.细胞株获得:得到适合工业化生产的细胞株,保种。,细胞株定向富集驯化,例如:激素自养型细胞株的筛选驯化:,将愈伤组织或分离到的细胞接种在不含生长素、分裂素的继代培养基中进行传代培
10、养,挑选生长好的细胞进行反复继代培养驯化,可以获得激素自养型细胞。,(二)次级代谢产物生物合成,莽草酸途径:喹啉类、异喹啉类、吡咯啶类、乌头类、吲哚类、大环类生物碱等。,聚酮途径:聚酮类化合物。,甲戊二羟酸途径:萜类、甾体。,紫杉醇(双萜类)生物合成4个异戊二烯GGPP19个酶促反应(Bacctin直接前体)、,C13侧链合成紫杉醇,GGPP,产物积累与细胞生长关系,a生长偶联型:产物合成发生在细胞生长过程中,到达平台期后合成停止。,b中间型:产物合成出现在细胞生长旺盛阶段,在平台期也能合成,但是速度减缓。,c非生长偶联型:产物合成出现在细胞生长平台期。,(三)工艺流程,(四)影响次级代谢产物
11、的因素,1 1.生物因素,(1)细胞株,稳定、高产、生长速度快的细胞株是细胞大规模培,养生产代谢产物的前提。,在进行植物细胞培养生产有价值的代谢产物时必须弄清楚产物的合成部位,也就是应该考虑到不同部位来源细胞的特性。,缺乏适合的细胞株是目前许多代谢产物无法利用细,胞培养生产的主要限制之一。,(2)细胞凋亡,细胞凋亡(Cell apoptosis),也叫程序性细胞死亡(Programmed cell death,PCD),是机体维持环境稳定、有基因控制的细胞自主的有序性死亡。,细胞凋亡是植物细胞培养过程中不可避免的现象,但是可以,通过条件改变进行调控来减少细胞凋亡。,关键是要保证充足的营养供给以
12、及避免有害代谢产物的积累,,这可以通过采用合适的培养工艺来实现。,(3)细胞团,植物细胞容易聚集成团,每个细胞团一般由4-300个细胞组成,大小因植物细胞种类不同具有较大差异,例如:烟草细胞团直径大约在350-1000m,长春花细胞团在40-2000m之间。,细胞团的形成影响稳定的悬浮体系的维持,同时造成了培养物的显著异质性,细胞团表面与内部的细胞存在营养吸收和代谢产物分泌的差异。此外,细胞团容易受剪切力影响而破碎,引起培养液粘度增加,致使气体交换与传递受到影响。要保持反应器良好的混合效果。,适当大小的细胞团有利于代谢产物积累。,(4)生物合成机制,次级代谢产物的生物合成不同于蛋白质合成,涉及
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