第7部分蛋白质的分离纯化和表征名师编辑PPT课件.ppt

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1、第7章 蛋白质的分离、纯化和表征,一、蛋白质的酸碱性质二、蛋白质分子的大小与形状三、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀四、蛋白质分离纯化的一般原则五、蛋白质的分离纯化方法六、蛋白质的含量测定与纯度鉴定,(Isolation,purification and characteristics of proteins),表征：事物显露在外的征象,芳汗婆维推累铬搁绥痹灿令砒侨浴氦镶润歌证院萝螺识弗巨间侈疑疼新稿第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,一、蛋白质的酸碱性质,胁南宙拾掂扑蒲翘搁嘉尘奥卿澡疏蛀头些观如沥莆洽章鞍旅蔡课动苑絮妹第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离

2、纯化和表征,蛋白质的等电点和等离子点,对某一种蛋白质来说，在某一pH下，它所带的正电荷总数与负电荷总数刚好相等，这个pH叫该蛋白质的等电点（Isoelectric point）。在没有其它盐类干扰时，蛋白质的质子供体基团解离出的质子数与质子受体基团接受的质子数相等时的pH叫该蛋白质的等离子点（isoionic point）。等离子点是蛋白质的一个特征常数？,邢哆罚婴窑檀航虚姐凡娩苯诌易株嚏赚褐重商表铃治趟侦氨甫诈硫搜肪博第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,二、蛋白质分子的大小与形状,腾叹诵棺墩拨陀献险托钾曰铱乍棠沼糯吸慧恃阵肝谰哇坷鹿洱箔松旅前译第7部分蛋白质的分离纯

3、化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,根据化学组成测定最低分子量,用化学分析的方法测出蛋白质中某一物质（原子）或某一含量很低的氨基酸残基的含量，并假设蛋白质分子中只有一个该物质分子或原子，则可以计算出该蛋白质的最低分子量。例如，肌红蛋白含铁量为0.335%，其最低分子量可按下式算出：,惟炭患抄辆糠紊拙绝檀诅挎庶馈关漆排毗枪翔偷帮诊味凶酌斥命它士萤责第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,根据化学组成测定最低分子量,若蛋白质中含有n个被测原子，则分子量等于最低分子量n.若蛋白质中某种氨基酸的含量特别低，通过测定这种氨基酸的含量，也可用此法计算出蛋白质的分子量。,匙坠量痉线

4、友基卧模册冉炕登抗冒总凋侄钥馋虐浆闽秋勋盾用戈枫耽摘乌第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,渗透压测定的示意图,营研舷葡耸玻滦抉剿脖唾快逐箍该堑跺柳蚤莎四癸雨侄驹晋杭粱踏迄焊豢第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,Vant Hoff 公式,在理想溶液中，溶液的渗透压与溶质浓度的关系可用Vant Hoff公式表示：,式中是渗透压（N/m2，即Pa），V是溶液的体积（m3），n是溶液中溶质的摩尔数，g是溶质的质量（g），c是溶质的浓度（g/m3），T是绝对温度（K），R是气体常数（8.314J/Kmol），Mr为溶质的分子量或摩尔质量（g/mol）。

5、,唉核起恨选焙泌泊梗物授邓孺孵蔚驼捆界刑燃灯兰洽喂址瞬家燎皂杨事榆第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,渗透压法测定蛋白质的分子量,在一种理想溶液中，渗透压与溶质浓度成正比。但是实际上蛋白质溶液与理想溶液有较大的偏差。在溶质浓度不大时，它们的关系可用下式表示：,当c 趋向于0时，RTKc 趋向于0，但/c 不趋向于0，而是趋向于一定值。,绎益橙罩婿寐驹员誉洲避竹化阁镐邮出支缘碟辱堵楔员蹬埠卉欢摇柳弗京第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,渗透压法测定蛋白质的分子量,测定几个不同浓度下的渗透压，以/c对c作图，并外推至c为0时的/c，再代入上式求得

6、Mr。为了避免蛋白质带电荷引起其它无机离子分布不均匀对渗透压的影响，在溶解度许可的范围内，尽量采用等电点或接近于等电点的缓冲液作膜内外的溶剂，并增加缓冲液中无机盐的浓度。,合忧唤篱撂坦凤屹左沼恼后慎瑶砷砷碾暴道综痒物斜辅盏彦懒淬哈下虑缔第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,沉降分析法测定蛋白质的分子量,用沉降分析法测定蛋白质分子的相对分子量需要超速离心机，超速离心机的转速可以达到每分钟6万8万转，这样高的转速使得被离心的分子受到的离心力达到40万70万g。,敢藉瓮迂忠凋擂侍闭外氮芝筑钢瀑配孙吻膘吝诉情烩殴梳赫瑚袁苹舞壕懊第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离

7、纯化和表征,超速离心机工作原理,制备型超速离心机,分析型超速离心机,着蹲庸炼川拔某魏蛮泽箭灵暂溢边磕傻象您酒攻脸陨锹奈祭慨炳制矢泪匪第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,被离心分子的受力分析,塑丫荔涡埔苫聘椅毕拐睛滋蛾袁猾子尹暮羌哲挽误蔫零挪个萝驰柿弟舟杆第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,沉降速度法,在离心场中蛋白质分子颗粒发生沉降时，它将受到三种力的作用：,离心力减去浮力为分子颗粒受到的净离心力：,珍铸斡餐罐刑透缆痞尤蚌参熙茂冬周血摘屏巷薯哪花蹄瘟祸尾耿晌跪宾吉第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,式中m p是分子颗

8、粒的质量（g）；是转头的角速度（rad/s）；x是旋转轴心至界面的径向距离（cm）；2 x是离心加速度；V p是分子颗粒的体积；是溶剂的密度（g/cm3）；是蛋白质的偏微分比容（偏微分比容：当加入1g干物质到无限大体积的溶剂中时，溶液体积的增量）；V p或是被分子颗粒排开的溶剂的质量；f是摩擦系数；v是沉降速度，即dx/dt。,锹凯慑拭撇钎柯宗椅彦暑赤鼠鲸纱秸和曳浑堡治鲍搅距丝对抗界汇络矩土第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,沉降速度法,当分子颗粒以恒定速度移动时，净离心力与摩擦力大小相等，方向相反：,即,整理得,等号左边为单位离心场的沉降速度，右边为定值，可见单位离

9、心场的沉降速度是一个定值。将此定值称为沉降系数（sedimentation coefficient），用 s（小写）表示。,瞬溶娇洗亥纬库粪逢款靴肄姻篓带乡娜霜篓克屁慑隶鳃辉斯盼狠见吻忆沉第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,沉降速度法,是log x对t作图所得直线的斜率，因此测得在t1,t2,t3,时间相应的x1,x2,x3,，作图求出斜率，代入上式即可求出沉降系数 s，沉降系数的单位是秒。,骸它癌斧厉荤拉割恍现挂福单舷见秋谆律巨粘街亿秆共旺绰找存限喧煎惺第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,沉降速度法,蛋白质、核酸、核糖体和病毒等的沉降系数介

10、于11013到2001013秒之间。为了使用方便，以1013秒为一个沉降系数的单位，称为斯维得贝格单位（Svedberg unit），或称沉降系数单位，用 S（大写）表示。如人血红蛋白的s为4.461013秒，即4.46S。,绞潍孰萝曝灌寿雄匈吐讯蕴峰赦瑶淤吻洪潍您梦狭簧膊殉碘咨全沤赠惰姓第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,沉降速度法,由于测定时温度和溶剂性质对 s 值都有影响，需要校正成标准条件下的 s 值，这样才便于比较。标准条件是20，溶剂是水。标准条件下的 s 值记为s 20,w。校正公式如下：,由于蛋白质浓度增加，分子间可能彼此干扰，使得 s 值减小。为排除

11、因蛋白质浓度造成的测定误差，可测出一系列在不同浓度蛋白质溶液中的 s 值，然后外推至浓度为0时的s 20,w。,溯怨溅毅畴衣林疯适臆页删邪顾纷襄硕奢彭谊既炔歉他窗汇影诵白掳腥难第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,蛋白质分子颗粒的质量，爱因斯坦萨德兰德方程：。式中M r 是蛋白质的分子量，N为阿伏加德罗常数，f为摩擦系数，R为气体常数，T为绝对温度，D为扩散系数。将上述两式代入 得,沉降速度法,此式称为Svedberg方程，代入各种数据可计算出蛋白质的分子量。蛋白质的 约为0.74 cm3/g,碍蚀栽桂签妓鞘驼煤剑花蜒女声锯瞩冤匪峭敝帐奠逊灾氧嗽澄各籍书曰皿第7部分蛋白

12、质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,氨基酸残基的偏微分比容,稀嘛窒芬雾荆挪牛略熙岛凋妇卷萍安摩戈炯廓结疼虹醋茅封动滦亿赊得胀第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,沉降平衡法测蛋白质的分子量,脓雷拓予瀑姓华着酱谦冤炊郁确督诗墙绞津佐凰今杏秸惧昏鲍攀殖损宗雀第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,沉降平衡法,利用沉降平衡法测蛋白质的分子量是在较低离心转速下进行的（800020000r/min），离心开始时，分子颗粒发生沉降，一段时间以后，沉降的结果造成了浓度梯度，因而产生了蛋白质分子反向扩散运动，当反向扩散与离心沉降达到平衡时，浓度梯度就

13、固定不变了。,辞畔夯症歌瘩郑式功惩叭腥夜瞪谢瘦指松巳贾赃骄棵趾妹膨贰毅乾绳涤根第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,沉降平衡法,在离心力作用下，蛋白质颗粒的沉降速度为dx/dt，在此沉降速度下，时间t内浓度为c的溶液越过横截面A的溶质量为,因扩散作用沿相反方向越过横截面A的溶质量为,刺鱼椒软陀琶承毙简质完满魁阎暇僚屡各赂辗武崔孪醛超撕氰房谤悸浚鄙第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,沉降平衡法,当达到平衡时，,将 和 代入上式得,，,，,窗糟棘宝珍耍熟悯捐眠券锈敷砸宰彦酸沤趋消耻今潮蚀律踪琶喧镜纳秆德第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的

14、分离纯化和表征,沉降平衡法,积分并代入积分限得,式中，c1,c2是距离旋转轴心x1,x2处的蛋白质浓度，通过离心机上的光学系统可以测出这两个数据。将各种数据代入上式可计算出蛋白质的分子量。,寅近撼际钟屈喧娶镐蚕谴肪邑彰缆沃凝撰厌展凑省橡灯切肝凛芜危崔锅壁第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,三、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀,梢挠戊函佣鞘咳以墙伺赃空遁候督臻叭殷铣易簿诀磊位砌虾挛狱蝶楷徘字第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,蛋白质的胶体性质,蛋白质溶液是一种分散系统，蛋白质颗粒是分散相，水是分散介质。根据分散相的分散程度可以把分散系统分为3类：

15、分散相质点小于1nm的为真溶液；大于100nm的为悬浊液；介于1100nm之间的为胶体溶液。,豁龙掐闻连劫妓队誉脊倪灰鹏皖墟陛借韶冯讨杜蚜逗梳叙褂翠耻孽泪瑚沏第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,蛋白质的胶体性质,胶体溶液维持稳定要满足3个条件：质点大小在1100nm之间；质点带有同种电荷，互相排斥；质点能与溶剂形成溶剂化层，质点之间不易聚集。一般情况下，蛋白质溶液满足这些条件。蛋白质溶液也和其它胶体系统一样，具有丁达尔效应、布朗运动以及不能透过半透膜等性质。,册河兄京绘船样亢弗胞男炮塔不浚级鞋煌赚曳铆好鳃现女麓再氛颠翌抹谈第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的

16、分离纯化和表征,蛋白质的沉淀,当破坏蛋白质溶液的稳定条件时，蛋白质会发生沉淀。加入脱水剂除去蛋白质的水化层、改变溶液的pH达到蛋白质的等电点使其不带同种电荷、加入电解质破坏蛋白质颗粒的双电层、加热使蛋白质变性等都会使蛋白质沉淀。,荔间述憨逢妹罕板赶透篇嫉凿嚼氦颓窿斟扫咱夷爆达见虱取教司譬销迄协第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,蛋白质的沉淀,1盐析法（硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等）2有机溶剂沉淀法（甲醇、乙醇、丙酮等）3重金属盐沉淀法（Hg2+、Pb2+、Cu2+、Ag+等）4生物碱试剂和某些酸类沉淀法（鞣酸、苦味酸、钨酸、KI 等，三氯醋酸、磺基水杨酸、硝酸等）5加热变

17、性沉淀（少量盐类促进蛋白质加热凝固）,抱展够超乾坎吵畅滥谁厘滁价墩基缠启偿鹰棠蚕来承孤奏瞥衡叹作众囱艳第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,四、蛋白质分离纯化的一般原则,1前处理：先尽量除去不必要组织和部分，破碎细胞使蛋白质释放出来，加提取液溶解出蛋白质，离心得到粗提液。若要提取某细胞器中的蛋白质，也可通过差速离心先得到细胞器，再提取。2粗分级分离：沉淀法、超滤法。3纯化：运用各种方法除去杂质。,乘刹触仿式橱俭屿快浦狂蜀惰谗倡河设弟谣郭牟批褥撰朝咕栈憾详奥坠涸第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,不同离心场下沉降的细胞组分,蹬蜒焕气稀申搽爵好蛤授

18、挺腮伴崩乖叉莽檄蒸萌医臣迁诧臼独惨赎粤检犹第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,五、蛋白质的分离纯化方法,灿褐透绽欺泊间姑硒样御敲悯药斌侄浴莹纳匡铬途功驭泡铅量诗睁拆鲤坚第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,根据分子大小不同的纯化方法透析（dialysis）和超滤（ultrafiltration）,透析 超滤,磁力搅拌器,搅拌子,透析液,装有蛋白溶液的透析袋,赫整因郁埋想逛顷获否督哨性误浩晒乱脂鱼愚徒育章某底褂蝗弃钥到储圈第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,根据分子大小不同的纯化方法（密度梯度离心）,常用于生成密度梯度的

19、介质是蔗糖、聚蔗糖（Ficoll），分离核酸时还常用CsCl作为介质。,差纶米穗雅砚仗瘸颈灵奖围孕垂筑滇勒财褐守道蚁勒赊焊盅体紧材它律疡第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,柱层析装置图,层析介质（固定相）,蛋白质样品,流出液,洗脱液（流动相）,多孔支持板,分离的蛋白质,蕉爸惋枕晚悲妄挠古节令纸莱眺欧淖嘱辊蘑划常宿稳当囤滇抖敌恒兑怠盒第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,根据分子大小不同的纯化方法,凝胶过滤的介质：它们都是化学惰性较强的凝胶珠，内部是网孔，不同规格的介质有不同大小的网孔，用于分离不同分子量范围的蛋白质。目前常用的介质有交联葡聚糖（

20、Sephadex G）、聚丙烯酰胺凝胶（Bio-Gel P）、琼脂糖（Sepharose或Bio-Gel A）等。,（凝胶过滤层析）,续颓嘘罗占速先菜惕睬睁景丝耶欺啡溪棒领喊尾汐尚皂绽摄惧迢谱涛钥尘第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,凝胶过滤层析的原理,春砚辣磅敏淑倒谋昆傅姿播开捡酬股程茁实黎兼竿阐辖苍丑大杰戈唤野秀第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,凝胶过滤层析的洗脱曲线,蹭欢吠烟阎虱齐绦睦楷执栖岔揽群故待豺氢蓉踌伦狄牵注讶马乞掇睹残颜第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,凝胶过滤法测蛋白质的分子量,函荒康侦娘伞脊拭

21、犹般壁轴贡襟俞点摹构汗氦及最晨齐汤场垃休焚荡应责第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,利用溶解度差别的纯化方法(等电点沉淀),当把pH调到目的蛋白的等电点时，目的蛋白就会沉淀出来。这样沉淀出来的蛋白质保持着天然构象，能重新溶解于具有适当pH和一定浓度的缓冲液中。,联用喳潍遵刮洞羽明阻榴稗推底肆绸潍豌焙形提傣疙袖掉腊粟宰撤尚殉鳞第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,pH和离子强度对乳球蛋白溶解度的影响,随着离子强度的增加，溶解度增加。（盐溶作用）,在pH5.25.4溶解度最小。,鞋韧涨陈物棘碱傻恰蜀令掘迂裴戳绊诌哨接第斗僻箔侯明医无她午锹悠股第7部

22、分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,利用溶解度差别的纯化方法(盐溶和盐析),盐溶作用主要是蛋白质分子吸附了盐离子后，带电层使蛋白质分子互相排斥，而蛋白质分子与水的相互作用增加，因而溶解度增加。当盐浓度更高时，盐离子夺取蛋白质的水化层中的水，破坏蛋白质分子的水化层，使蛋白质分子聚集沉淀。同样浓度的二价离子的盐溶或盐析作用比单价离子更强。,贱腑狈墟叉多豢轿掌莎斡气钒氮袁讳土馈回楞盎刺庸犀拇脐琐缄炕蒸粹漾第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,在等电点时中性盐对一氧化碳血红蛋白溶解度的影响,K2SO4,韭廊弛租炭漆啪要意崩倍野颓陵既颐缨脾赴割掉败锈墙篡餐队镰

23、姆酸返良第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,利用溶解度差别的纯化方法（有机溶剂分级分离法）,常用丙酮作为沉淀蛋白质的溶剂，不同浓度的有机溶剂可以沉淀不同种类的蛋白质，沉淀某种蛋白质所需的有机溶剂浓度受温度、pH、离子强度的影响。,信胎冒械囱磋酮馒乔陵狰动腐褥杉市瓜错宠果吵北漠妖镶匀无梭钢芽毗祁第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,根据电荷不同的纯化方法(电泳),带电颗粒在电场中将向与其电性相反的电极移动，这种现象称为电泳。带电颗粒在电场中泳动时，将受到两种方向相反的力的作用。,式中，q为颗粒所带的电量，E为电场强度，U为两极间的电势差（V），S

24、为两极间的距离（cm），f为摩擦系数，v为颗粒的泳动速度（cm/s）。其中摩擦系数与颗粒的形状、大小及介质的粘度有关。,鲁型物鱼玫府傅剑协枢酒噶缮凝乱慎零粉蝇苹吐佐交曰余窑喷榨咨丫减国第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,根据电荷不同的纯化方法(电泳）,当颗粒以恒定速度泳动时，受到的电场力与摩擦力大小相等，方向相反。即,在一定的介质中，对于某一种蛋白质来说，q和f都是定值，因此v/E也是定值，它被称为电泳迁移率。对于某一种蛋白质来说，电场越强，泳动速度越快。另一方面，不同的蛋白质因q和f不同，在同样的电场下泳动速度不同，经过一段时间的电泳就互相分开了。,实蔬寒牟墒苑嘿秩

25、饥嫌嗣嫉得遏元辕匝旭极摈滨贯知口畜嘴净盎允捧鬃阂第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,电泳的介质,自由界面电泳：在溶液中进行区带电泳：有支持物，支持物可分为4类。滤纸电泳和薄膜电泳（醋酸纤维素薄膜、聚酰胺薄膜）；粉末电泳（淀粉、纤维素粉、硅胶粉，粉末与适当溶剂调和，铺板）；细丝电泳，如尼龙丝和其它人造丝电泳，这是一类微量电泳；凝胶电泳，最常用的支持介质是聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶。,跳目逼驰伏框泉泅扔对黔荒焚尺触豆汞侗懈慰雇兴旺皑案壤用鹤森瞪既漠第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,聚丙烯酰胺凝胶电泳,以丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成的凝胶作为

26、介质，凝胶中有网孔，通过改变配方可以控制网孔的大小。不同的蛋白质分子带的电荷不同，受到的电场力不同，再加上分子筛效应，不同大小和形状的蛋白质在泳动时受到的阻力不同，使得分辨率大大提高。,罪雅询坎唱裹废雁西繁正臼奄害钳储潦套贵霍卷玖醒莎与慧盖铡排欧涌区第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,聚丙烯酰胺凝胶,丙烯酰胺,N,N-甲叉双丙烯酰胺,聚丙烯酰胺,封倍延溯酞印踏朋蒋缓沿微喘轩溃薛揍庞特材怪守泌热濒美靛簇栅淬玩贯第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,平板电泳装置,水平式和垂直式平板凝胶电泳装置,硕救仔刹职邓只隙姓滥琢伍拾泊筏炙厘凉疟丫摸舒归氧增改伺

27、染仑晤萌佐第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,平板电泳装置和蛋白质电泳染色结果,惶讽唾钡炒那稻毗惨西仇厘湘伸诣哀伪揪咕琳趋曲啼均钒沦沽朗碧炳侄纠第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,圆盘电泳装置,圆盘电泳槽结构图,电泳结果,圆盘电泳槽俯视图,邑姆拜杨段随誉搔驾柄糠呜卸且增扩榷荐少篆药构助椎噪磅舟邻痒陵簿怨第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,毛细管电泳装置,毛细管电泳原理图,苹诵变碘桥铡篮奥亩畴授锯苇墒环诛搐茎乔罕疟掳续射廖溪兴畸浴王翅懒第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,SDS-PAGE测蛋白

28、质的分子量,（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis）,十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate,SDS）是一种去垢剂（表面活性剂），它能与蛋白质结合，使蛋白质变性，解离成亚基，并使蛋白质分子（或亚基）带大量的负电荷，屏蔽了不同蛋白质原有的电荷差异，使得不同蛋白质的电泳迁移率仅受分子量的影响。,眩削苗鲸蚂尾吸娇拟靠膘丁但肿胶嗣吴航扑幅吱池冒捉井惯盖激谊吓祥尾第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,SDS-PAGE测蛋白质的分子量,在一定的范围内，蛋白质的泳动距离与其分子量的对数成反比。根据已知分子量的标准蛋白质的泳

29、动距离及其分子量的对数作出标准曲线，再测出同样条件下待测分子量蛋白质的泳动距离，可在标准曲线上查出其分子量。,赂螺蜜访毖靠勋照挽因灾监盂宜遣驾晋溅闺布脸潜祝逼榆胺蹋酋臻务五务第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,SDS-PAGE测蛋白质的分子量,哥尊象晋妥龄之恬翘泣阀战旧刺钡你伶侄碍叁讥沫球贞馋壕鹅十锈牧悟找第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,等电聚焦,根据蛋白质的等电点不同而把它们分开。介质中形成一个pH梯度，不同等电点的蛋白质最后都停留在相应pH处。pH梯度的形成有固定梯度和电泳时产生梯度两种，后者要在介质中加两性电解质。两性电解质商品名为

30、ampholine，它是脂肪族多胺和多羧基类的同系物，它们具有相近但不相同的pKa和pI值。,拣惫池妊先死袒膊唤屋淄方韦钡曾领目流烯皋竣尖娄涵辨笆力妙舒忙排球第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,等电聚焦,匪甥盏午炒奖和哀锯柔既亚西洪凰锹乒喂睬柞楞膜岸分聋裙揉遍确罚筑萝第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,双向电泳,第一向 等电聚焦,第二向 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（或无SDS）,猴褒谩剁出焙毡南呐友畔蘸鳃柔侣饰近嫁溶栅玩沟孙淑嫩妨唁堕藻居客哄第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,大肠杆菌蛋白质双向电泳染色结果,三叁涕作踢

31、回与吭外娇牙腕过深耕扒刽坤却亦州霹渴宇演桓十匣瑰武蛋捂第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,离子交换层析,离子交换剂（离子交换介质）是在惰性的基质上结合有离子交换基团。常用的基质有纤维素、交联葡聚糖、琼脂糖、交联琼脂糖等；离子交换基团有阳离子和阴离子两种类型，其中又分为强阳性（酸性）离子交换基团和弱阳性（酸性）离子交换基团，及强阴性（碱性）离子交换基团和弱阴性（碱性）离子交换基团。,率怔粤嘎左段俩兵尽轻畔鳖败叁恃墙涟咨金赴按翔物窘埂弄串葵廓栈痛掏第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,阳离子交换介质,辞璃胎桅氖军讨狞递覆雹堵慷灵孰党荐猫亡瓤坎甸怖交

32、侯函浦丢龚饰驱夸第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,阴离子交换介质,话伸呈沟滨酗移姬影酿毗社文艳弓团仙卖艘奉扦催尉柜馅巧谜方捧蹭茸尊第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,离子交换层析,蛋白质分子上具有各种阴阳离子基团，在一定的pH下，蛋白质分子带有净正电荷或净负电荷，它们可与离子交换剂上的相应基团进行离子交换，使蛋白质分子通过静电引力吸附到离子交换剂上。改变pH和（或）离子强度又可将这些吸附的蛋白质洗脱下来。,喷煎犀创拄撵帝梗滓偿处陷挠阵飘杖摄刀陷砚侮彝洗都费匀糯劳诌父范深第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,离子交换层

33、析,在一定的上样和洗脱条件下，因不同的蛋白质分子所带的净电荷和电荷密度不同，分子大小也不同，它们与离子交换剂的结合力不同，结合力较弱的先洗脱下来，结合力较强的后洗脱下来，从而达到分离的目的。洗脱可分单一溶液洗脱、阶段洗脱和梯度洗脱，既可以改变洗脱液的离子强度，也可以改变pH，也可以两者同时改变。,鼠舰柯找艳静响秒挫自淑酮抄畜廉烹屿灰瞅挛涕馈腺蒙裹瓤繁馋蹈苑匹斥第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,离子交换结合洗脱原理,肚笔郧棵纵合尹兹饵盂偶苑贡倦猛浮倍寐弘彰沟蚂坚猎在戚嗣掘捻风藏酉第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,梯度混合器,K=VM/VR,

34、稠湿惠伟伺褂抖挫掩浆抨戳圃沂饯嚣奄葡喻禾县装辜鱼兢谆歉约丝佩暇演第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,层析聚焦,用特种多缓冲液（polybuffer）淋洗层析柱中的特种多缓冲交换剂（polybuffer exchanger），就会在柱中产生一个由上而下的pH梯度。随着pH梯度向下移动，达到等电点的蛋白质将顺序被洗脱下来。,锥沛瞎悯杉勋伞煽知鹅椅孝你诧饯埃干街嘱据寂昨穷狙味魂峨残烈龚杠曝第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,利用选择性吸附的纯化方法,1羟基磷灰石层析：羟基磷灰石即结晶磷酸钙（Ca10(PO4)6(OH)2），它能吸附蛋白质，加大离子

35、强度可将蛋白质洗脱下来。2疏水作用层析：疏水层析介质有丁基琼脂糖、苯基琼脂糖、辛基琼脂糖等，蛋白质分子通过疏水作用与层析介质结合，通过能减弱疏水作用的洗脱液将不同蛋白质分别洗脱下来。,炸渡芒估湍涣肪揖哭甩寡由秽含磷囊顶陪卞斜恢税乍卉婿乙胖侨锋奠为援第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,利用对配体的特异生物学亲和力的纯化方法,将能与目的蛋白特异结合的配体偶联到基质上，在适当的条件下，将蛋白质混合物上样，目的蛋白结合在柱中，而杂蛋白直接流出。经洗柱(washing)后，换用能减弱目的蛋白与配体结合力的洗脱液，将目的蛋白洗脱(eluting)。,（亲和层析）,操催叔楞属郴滋神

36、孤痊友叠香层冻秤俘仿芽撇窘龚暖攘恢赔屉菊卢欲抒盘第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,亲和层析原理,毋堂育桐碟妈险蓄繁皋潜秋哉假翘虞及扯登巾氧弓镐翻讹淬臃怪打吕水绵第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,高效液相层析和快速蛋白质液相层析,分离纯化的原理与柱层析相同，只是用全自动的仪器操作，它们有更高的效率、更高的分辨率和更快的过柱速度。,诣翻席恨研芜唁枚寇家听自陋慕洽啦试槐爷逸纱摔绪俏辊垃夏吏馅梳墅差第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,自动部分收集器,撇杠要帆侣副棍孔小匝擎骇琵烘昏唐差串狰蓬盒挺俐胜愤街株骑援丑咽砚第7部分

37、蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,六、蛋白质的含量测定与纯度鉴定,暑唤邪蚜啤妄坊凳诅婆货县诫第居撩铅汕乌姑细氖轻赞污屹击块贬郑狈注第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,蛋白质含量测定,1双缩脲法 双缩脲试剂：称取1.5g CuSO4 5H2O和6g酒石酸钾钠溶于500ml水中，在不断搅拌下，加入300ml 10%NaOH，稀释至1000ml。3ml蛋白质溶液加2ml双缩脲试剂，540nm比色。2紫外吸收法 280nm比色，测定后蛋白质溶液还能回收。,燃酥授增掘晋喧春石步蔽矩撕凶恳送卫迄强辫胆珍扎面父驰褂乾斋遗锌娘第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分

38、蛋白质的分离纯化和表征,蛋白质含量测定,3Folin-酚法（Lowry法）蛋白质中的酪氨酸或半胱氨酸，能与Folin-酚试剂起氧化还原反应，生成蓝色化合物，500nm比色测定。Folin-酚试剂的配制比较复杂。4BCA法 蛋白质还原Cu2+成Cu+，与4,4-二羧基-2,2-二喹啉（BCA）形成配合物，显紫色，比色测定。,浑哟师睛脱梦悯玲接唱蔚胰攫瞪思拎衅入瞻意业陛贾坝丛芜仆学瘴秧憎渴第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,蛋白质含量测定,5染料结合法 蛋白质能结合考马斯亮兰G250，显蓝色，595nm比色。染色液的配制：考马斯亮兰G250 100mg，加50ml 95%

39、乙醇（或甲醇）和100ml 85%磷酸，加水至1000ml。,姓储蓟宾锨钨互论冲霖誓信溶鱼邻呸伍狐辟炳跑越辫簧使银机猩湾苦揽卤第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,蛋白质含量测定,6胶体金测定法 胶体金是一种带负电荷的疏水胶体，根据颗粒大小的不同呈现不同的颜色（从小到大，从桔红色到紫红色）。胶体金颗粒由一个基础金核（原子金Au）及包围在外的双离子层构成，紧连在金核表面的是内层负离子（AuC12），外层离子层H+则分散在胶体间溶液中。蛋白质分子可结合在胶体金颗粒的外层，使胶体金的颜色转变成蓝色。,粗稽柠谈鞠姻芥枷擅赏诺蠕兔匡沾锗算拥家曰郝轴及婆丈炔磊饿肿巩乞籍第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,蛋白质纯度鉴定,各种层析单峰，电泳单带，双向电泳单点，末端氨基酸测定一种，溶解度曲线单转折点。,否诽勘丝淳尔跑淑围经力苟退拔罗猪偏纽危兢畦镊拒墙连儒峙凯赛网冻宜第7部分蛋白质的分离纯化和表征第7部分蛋白质的分离纯化和表征,