第9章细菌和病毒的遗传作图.ppt

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1、第9章 细菌和病毒的遗传,本章重点,1细菌影印法。,3细菌和病毒的四种遗传分析方法：转化、接合、性导、转导。,4掌握F+、F-、F、HfrF+的特点。,5理解和掌握中断杂交和重组作图的原理。,2噬菌体结构和基因重组特点。,？,自主学习题,解释下列名词:基本培养基 完全培养基 原养型 营养缺陷型 溶源性细菌 转化 接合 性导 转导 普遍性转导 特殊性转导 烈性噬菌体 温和噬菌体 中断杂交作图 F+菌株 F菌株 Hfr菌株部分二倍体,一、细菌,1、大小：,比较小的单细胞，大约12m长，0.5m宽,2、结构：简单，包括细胞壁、细胞膜、拟核、核糖体、细胞质及内含物；特殊结构：如荚膜和鞭毛 见教材：14

2、5页图7-16,第一节 细菌和病毒遗传研究的意义,细菌,细菌属于原核生物，不进行典型的有丝分裂和减数分裂，因此，其染色体传递和重组方式与真核生物不尽相同。,4、涂布和繁殖：,细菌每个细胞在较短时间内（如一夜）能繁殖107个子细胞 成为肉眼可见的菌落或克隆。,单个主染色体，一个或多个小染色体（质粒）,3、遗传物质：,5、细菌遗传的研究方法-平板培养,6、细菌菌落的表现型,、原养型（野生型）：在基本培养基上能正常生长的细菌。,、突变型：在基本培养基上不能正常生长的细菌。,、生理突变型,A、营养缺陷型,B、抗性:抗药或抗感染,、表型突变型,菌落大小、颜色、形状,7、突变发生的测定影印培养法,完全培养

3、基,选择培养基,选择培养基,选择培养基,二、病毒,1、病毒的一般特性,无细胞结构：为蛋白质外壳包裹核酸而成的颗粒。,遗传物质：只含一种核酸（DNA或RNA）。,繁殖方式：只能依赖宿主活细胞的代谢机器，通过核酸复制和蛋白质合成后再装配成完整的病毒颗粒的方 式进行繁殖。,其体积大小相差悬殊，绝大多数直径在10300 nm之间。其形态多种多样。,病毒的形态结构借助电子显微镜才可以观察到。,2、病毒的分类,宿主,、细菌病毒噬菌体,、植物病毒,、无脊椎动物病毒,、脊椎动物病毒,、亚病毒,、类病毒（viroid）,、拟病毒（virusoid）,、朊病毒（prion),三、细菌和病毒在遗传研究中的优越性,(

4、6)、便于进行遗传操作。,(1)、世代周期短。大肠杆菌每20分钟可繁殖一代，病毒每小时可繁殖数百个后代。,(2)、易于管理和进行化学分析。,(3)、是单倍体，便于研究基因的突变和重组。,(4)、遗传物质简单，便于研究基因结构、功能。,(5)、可用作研究高等生物的简单模型。,第二节、噬菌体的遗传分析,一、噬菌体的结构,二、T2噬菌体的基因重组与作图,三、噬菌体的基因重组与作图,细菌病毒是研究得比较清楚的病毒。噬菌体侵染细菌后在均匀生长的细菌培养板上形成噬菌斑（plaque）。根据噬菌斑的形态和生长特点可以鉴别不同的噬菌体。,一、噬菌体bacteriophage，phage的结构,T4噬菌体形态,

5、T4 phage的结构模式,噬菌体的分类,按其在宿主细胞中的生活方式分为：温和噬菌体：在噬菌体侵入后，细菌并不裂解，而是以溶源体或质粒的形式存在的一类噬菌体称为温和性噬菌体。烈性噬菌体：噬菌体侵入宿主细胞，利用宿主细胞内的物质进行自身合成子噬菌体，并使宿主细胞裂解而释放子噬菌体，这类噬菌体称为烈性噬菌体。,烈性噬菌体virulent phage,噬菌体的生活周期,烈性噬菌体的生活周期,吸附、侵入、核酸的复制、转录与蛋白质的生物合成、装配、释放。,、吸附,、侵入,、核酸复制,、转录,、装配,、释放,温和噬菌体的生活周期,具有溶原性（lisogeny）的生活周期。侵入细菌以后，细菌细胞并不马上裂解

6、。,噬菌体（phage）,侵入细菌后，细菌并不裂解。噬菌体的DNA通过交换整合到细菌染色体上。随着细菌DNA一起复制。,噬菌体,溶原性细菌（lysogenic bacterium）。,DNA整合在寄主染色体中的噬菌体称为原噬菌体（prophage）。,含原噬菌体的宿主细菌称为溶原性细菌。,溶源周期裂解周期：,原噬菌体通过诱导（induction）可转变为烈性噬菌体，进入裂解周期。诱导方式：UV、温度改变、与非溶原性细菌接合等。诱导使阻遏物失活，噬菌体的基因表达，进入裂解周期。,P1 噬菌体(P1 phage),感染E.coli以后，不整合到细菌DNA上，而是独立存在于寄主细胞内。不影响宿主细胞

7、的正常代谢 P1 DNA 自主复制，并分配到宿主的子细胞中去，而且可以多于一个拷贝。受P1 噬菌体感染的细菌也可以因诱导而进入裂解周期。,一个正常的T2 phage产生的噬菌斑小而边缘模糊，记为r；突变体r-产生的噬菌斑大而边缘清晰。r-T2 噬菌体是速溶（rapid lysis）突变体。,二、T2噬菌体的基因重组与作图,噬菌体遗传性状,噬菌斑的形态,正常的T2 噬菌体能感染E.coli B株，h。E.coli的突变型B/2株能抗T2的感染。h的突变型h-能克服B/2株的抗性，既能侵染B株又能侵染B/2株。,宿主范围,T2 phage 和 E.coli的关系,混合感染（mixed infect

8、ion）：,两个基因型不同的噬菌体同时感染一个宿主细胞，又称为双重感染（double infection）。共同生存在同一个宿主细胞中的两个噬菌体DNA也可以发生交换，产生基因重组。,T2 基因重组试验：,用基因型为rh-和 r-h的两种T2 噬菌体同时感染E.coli B株（双重感染）。将双重感染后释放出来的子代噬菌体接种在同时长有B株和B/2株的培养板上，记录噬菌斑的数目和形态。,hr 半透明，大 hr 透明，小 hr 透明，大 hr 半透明，小,亲本型,重组型,重组率（Rf）100,基因型,表现型,重组噬菌斑,总噬菌斑,T2 plaques,h+r+,hr+,h+r,hr,半透明，大,透

9、明，大,T2 phage重组试验结果,注：不同速溶性噬菌体的突变型在表现型上不 同，可分别写成ra、rb、rc等,根据上表结果可以分别作出3个连锁图,有四种可能的排列顺序,基因顺序的精确确定,杂交：rcrb rc rb,Rfrcrb14,rc h rb,可以先只考虑 rc、rb 及h来确定三者的顺序,由于噬菌体的连锁图是环状，所以2、3排列都对。,h,rc,rb,ra,12.3,11.7,1.6,作图,Kaiser(1955)，噬菌体的重组作图。用UV照射获得了5个phage的突变型：s型，噬菌斑较小，mi型，噬菌斑特别小，c型，噬菌斑完全清晰，co1型，噬菌斑中间模糊，四周清晰，co2型，噬

10、菌斑的中部较co1型更为浓密。,三、噬菌体的基因重组与作图,溶源性受到干扰，只能进入裂解周期，故斑清亮,噬菌体s co1 mi 的杂交结果及分析作图,s co1 mi,Rf双交换（513）/2091X1000.86%,Rfsco1（3032）/2091X1000.86%3.76%,Rfmico1（6151）/2091X1000.86%6.16%,3.76,6.16,噬菌体s co1 mi 基因连锁图,细菌遗传物质的重组有四种不同的方式：转化（transformation）接合（cojugation）性导（sexduction）转导（transduction）,第三节 细菌的遗传分析,一、转化（

11、transformation）,细菌通过细胞膜摄取周围环境中DNA片段，并通过重组将其整合到自身Chr中，而使它的基因型和表现型发生相应变化的现象。,野生型肺炎双球菌菌落为光滑型，一种突变型为粗糙型，两者根本差异在于荚膜形成,荚膜的主要成分是多糖，具特殊的抗原性。不同抗原性是遗传的、稳定的，一般情况下不发生互变。,Griffith肺炎双球菌转化试验及其结果,转化试验,转化特征：,转化现象在细菌中是一种普遍现象。不同细菌转化过程有一定差异，但是它们都存在几个方面的特征，,感受态指细菌能够从周围环境中吸收DNA分子进行转化的生理状态。,感受态主要受一类蛋白质(感受态因子)影响，感受态因子可以在细菌

12、间进行转移，从感受态细菌中传递到非感受态细菌中，可以使后者变为感受态。一般认为感受态只能发生在细胞生长周期的某一阶段。,1、只有当细菌处于感受态时，细菌才能转化。,2、并非所有外源DNA片段都适合转化，只有双链、而且相当大的外源DNA片段才能够转化。如：转化肺炎双球菌的DNA片段至少要有800bp，而枯草杆菌最少需要16000bp。3、只有当整合的DNA片段产生新的表现型时，才能测知转化的发生。4、因为在细菌的细胞壁或细胞膜上有一定数量的DNA接受位点。在达到饱和之前，对某一个特定基因来说，存在的供体DNA分子数目与转化子数目成正比。,感受态,转化过程,、结合(binding)：,、穿入,当细

13、菌细胞处于感受态时，供体(donor)双链DNA分子可结合在受体(receptor)细胞表面的结合位点上。一旦受体位点饱和后，将阻止其它双链DNA的结合。,稳定结合在受体位点上的双链供体DNA，由外切酶或DNA移位酶降解其中的一条链，而另一条链进入细胞中。,、联会,、整合(integration),供体的单链DNA片段与其相应的受体DNA片段联会，联会也可发生在异种DNA之间，这主要取决于种间亲缘关系的远近。,是指单链的供体DNA与受体DNA对应位点的置换，从而稳定地渗入到受体DNA中。它对同源DNA具有特异性，异源DNA视亲缘关系远近，也可发生不同频率的整合。,A,B,A,B,A,单转化A,

14、B,单转化B,A,B,并发转化A、B,转化作图,并发转化：当两个基因紧密连锁时，它们就有机会同时被转化。并同时整合到受体细胞染色体上。,、转化作图原理,相邻基因共转化的频率与基因间距离成反比，即基因间距离越近，发生共转化频率越高；反之越低。,基因间距离与重组类型频率间呈正比，即基因间距离越远，重组类型频率越高。重组类型即为单基因转化产物。,A,B,A,B,并发转化A、B,A,B,B,单转化B,A,B,单转化A,A,A、B间距离越近，A、B双转化频率越高，A转化频率、B转化频率越低,A、B间距离越远，A、B双转化频率越低，A转化频率、B转化频率越高,trp2+his2+tyr1+（供体）trp2

15、-his2-tyr1-（受体）的转化类型及重组率计算,例1：枯草杆菌共转化遗传作图,trp2,his2,tyr1,34,13,连锁遗传图,trp2,his2,tyr1,34,13,40,在原核生物中，两个细胞在相互接触过程中，遗传物质从一个个体转移到另一个个体的现象称为接合。,概念,二、接合conjugation,接合的发现,J.Lederberg&E.Tatum 大肠杆菌杂交试验（1946）：,结果：平板上长出原养型菌落(+)。,材料：大肠杆菌K12菌株的两个营养缺陷型品系：,菌株A甲硫氨酸缺陷型 met-和生物素缺陷型 bio-；,菌株B苏氨酸缺陷型 thr-和亮氨酸缺陷型 leu-,方法

16、：将A、B两菌株混和，在基本培养基(固体)上涂布培养。,细菌的接合试验,回复突变的排除,单基因回复突变的频率约为10-6，,双基因回复突变的频率则为10-12，频率很低。,但试验中原养型菌落产生的频率非常高（10-7），因此基本可以排除回复突变的可能。,互养作用的排除,材料 A品系：A-B+T1S(met-bio-thr+leu+T1S)B品系：A+B-T1R(met+bio+thr-leu-T1R),结论：表明互养并非原养型菌落出现的原因，而可能发生了遗传重组。,试验方法：将A、B品系混合接种在基本培养基表面，短时间后喷噬菌体T1杀死A品系，使其不能持续产生thr与leu供B品系持续生长。,

17、结果：仍然出现原养型菌落。,喷噬菌体T1杀死A菌,转化作用的排除,加热法,加热,戴维斯的U形管试验,细胞直接接触是原养型细菌产生的必要条件。,W.Hayes通过实验（1952）证明，在接合过程中遗传物质是一种单向的转移。即遗传物质从A菌株转移到了B菌株。,供体（雄性）受体（雌性）A B,W.Hayes等进一步研究发现，A菌株之所以能成为供体，是因为它有一个性因子，即致育因子（fertility factor），简称F因子。,目前研究表明F因子为环状DNA分子。,E.Coli F因子的三种存在状态：,、没有F因子受体菌（雌性菌）：不含有F因子的细菌，记为 F,、游离状态的F因子供体菌（雄性菌）：

18、含有F因子的细菌，F因子游离于宿主染色体外，记为 F。,+,、整合的F因子Hfr菌株（高频重组菌株）：指 F 因子整合到宿主染色体中去了的菌株，其重组频率比 F+高1000多倍。,F因子的结构,F因子的特点,F细菌可以把F因子传给后代,F可以和F杂交，而不能和F杂交。,F和F杂交后代皆为F，而且可以以10 频率获得重组体后代。,7,性伞毛/接合管,接合过程,、F因子的转移低频重组 F+F-=F+F+重组通过质粒转移、复制进行。,接合过程示意图,高频重组,高频重组细胞的形成,、Hfr细胞染色体的转移,Hfr F-Hfr F-Hfr F-时，细菌基因的重组频率增加千倍。,Hfr菌株的形成及其基因转

19、移,、高频重组中基因的转移,部分二倍体：,当Hfr菌的部分染色体进入F细胞后，F细胞中就成为部分二倍体（partial diploid）或部分合子（merozygote）。新转入的DNA片断称为供体外基因子（exogenote），而受体的染色体称为受体内基因子（endogenote）。,部分二倍体及其交换,Hfr品系与F菌株的异同,、高剂量链霉素处理后都不影响杂交，说明它们都是作为一种供体。,相同,、都能和F-杂交,、杂交都要通过接合管和受体菌相联接,不同,、产生重组子频率不同：,4,7,、产生的后代不同：,F F 后代F，HfrF 后代F。,HfrF 10，F F 10。,中断杂交试验,Hf

20、r中的DNA向F转移时，是从酶切端点开始直线式进行的。因此可以用于基因作图。,中断杂交试验：,Hfr：strs thr+leu+azis tonAs galb+lac+F：strr thr-leu-azir tonAr galb lac strr 对链霉素有抗性 azir 对叠氮化合物有抗性 tonAr 对T1噬菌体有抗性 thr+leu+galb+lac+对苏氨酸、亮氨酸、半乳糖和乳糖为原养型,实验方法与步骤,、混合培养,、根据基因转入F 的时间 进行细菌染色体作图,、每隔一定时间取样，搅拌,、测试形成的F 菌落的基因型，确定每个基因转入F 的顺序（时间）,1分钟20%的重组值,1分钟20%

21、的重组值,1分钟20%的重组值,、在含str的完全培养基上，Hfr被杀死,中断杂交后，接合后体中各个性状出现的频率,大肠杆菌Hfr strs thr+leu+azis tonAs galb+lac+F-strr thr-leu-azir tonAr galb-lac-的结果,根据中断杂交试验绘制的连锁图,F因子插入的位置及方向,F因子和细菌染色体都是环状,用不同的Hfr菌株进行中断杂交实验，基因转移的原点(O)和转移方向不同，表明F因子和细菌染色体都是环状。,用中断杂交试验确定的几个Hfr菌株的基因顺序,作图：,重组作图,如果两个基因间的转移时间小于2分钟，用中断杂交法所得的图距不太可靠，应采

22、用传统的重组作图法。,Hfr lac ade str F lac ade str,+,+,-,-,-,s,r,经中断杂交试验，lac 基因在ade 基因的前面。,、ade 重组的两种形式：,Hfr染色体,受体染色体,lac,ade,基因型：,Hfr染色体,受体染色体,lac,ade,基因型：,、计算公式,Rf,lac-ade+,(lac+ade+)+(lac-ade-),100%,中断杂交试验结果表明，lac-ade间的距离为1min,而用重组作图法算出的重组率为20%，因此，一个时间单位（1min）相当于20%的重组率。,大肠杆菌染色体图,三、性导,1、概念：带有F因子的细菌在接合时，由F因

23、子所携带的外源DNA便转移到宿主细菌的染色体上，这一过程称为性导。,2、F因子,、概念：Hfr菌株在切除F因子时发生错误切除，分离出一个携带F因子和部分宿主染色体基因的遗传因子，这种带有宿主染色体基因的F因子称为F因子。,F因子的形成,F因子,lac+,ton,lac+,ton,Hfr,F因子,lac+,ton,ton,lac+,F因子,3、F携带的基因转移,ton,lac+,ton,lac-,F因子,ton,lac-,lac+,F因子,部分二倍体,Lac+,ton,重组体,4、F因子的特点,、F因子以极高的比率转移它携带的基因,、F因子有极高的自然整合率，而且整合在一定的基因座位上，因有与细

24、菌同源的染色体区段，不同于F因子随机插入。,5、F因子 与F+、Hfr的关系,5、性导作图,两个位点必须密切相连，才能处在同一个F因子上。然后计算两个位点间的重组频率，这样就可以获得每个片段的连锁群。作图方法同转导作图。,四、转导,1、概念：以噬菌体为媒介所进行的细菌遗传物质重组的过程，称为转导。,2、转导的发现：,原因?可能为接合或转化引起的？,、鼠伤寒沙门氏菌 1952 Lederbery及其研究生Zinder发现。,说明遗传物质的转移是通过一种可通过滤膜的过滤性因子（FA）实现。,、接合的排除-U型管实验,、转化作用的排除,LA22,LA2,高温杀菌,加DNA酶,原养菌落,LA2,LA2

25、2,高温杀菌,加DNA酶,原养菌落,FA不受DNA的破坏。,研究结果表明：FA就是温和噬菌体P22。,3、转导的类型,、普遍性转导,、概念：P1、P22这类噬菌体可以转导细菌染色体组的任何部分，这类转导称为普遍性转导。,、普遍性转导中遗传物质的转移,普遍性转导,、普遍性转导遗传作图,、作图原理：,因此，测定两基因的合转导频率就可以确定基因之间的秩序和距离,两个基因同在一起转导就是合转导或叫并发转导。,合转导的频率愈高，表明两个基因在染色体上的距离愈近，连锁愈密切；相反，如果两个基因的合转导频率很低，就说明它们之间距离较远。,A、两因子转导：通过观察两个基因的转导，计算并比较每两个基因之间的合转

26、导频率，就可以确定三个或三个以上基因在染色体上的排列顺序.,例如：a基因和b基因的合转导频率很高，a和c基因的合转导频率也很高，而b和c很少或完全不在一起转导，这三个基因的次序就应为：bac,、作图方法,以E.coli的P1噬菌体进行下列转导：,供体thrleu azir 受体thrleuazis先用P1 噬菌体感染供体菌株，再用来自供体的新一代P1噬菌体感染受体菌株。然后检测受体菌基因型。,检测结果：,选择标记 非选择标记1 leu+50%azir，2%thr+2 thr+3%leu+，0 azir3 thr+leu+0%azir,课后17题：(自学）,实验 选择的标记基因 未选择的标记基因

27、,1,pur,prohis87prohis0prohis10prohis3,2,pro,purhis43purhis0purhis55purhis2%,3,his,purpro21purpro15purpro60purpro4%,实验1：pur与his近、与pro远,pur,his,pro,或,pur,his,pro,实验2：pro与his、与pur远,pro,pro,his,his,pur,pur,综合实验1、实验2，三者之间的顺序如下：,pur,his,pro,实验3：his与pur较近、与pro更近。进一步说明上面的结果是正确的。,B、三因子转导：只需分析一个实验的结果就可以推出三个基因

28、的次序,最少的一类转导体应代表最难于转导的情况，这种转导体是同时发生交换次数最多的一类。这种转导体的两边应为供体基因，而中间为受体基因，如正确次序为abc，就应为a+bc+。,例如：供体大肠杆菌具有基因型a+b+c+，受体的基因型为abc。,a,b,c,a,b,c,、abc,、abc,、abc,双交换,a,b,c,a,b,c,、abc,、abc,、abc,a,b,c,a,b,c,四交换,abc,假定由实验得到的最少的转导体类别为a+b+c，那么就可以确定，这三个基因的正确次序应当是acb或bca。,a c b,例：课后16题,供体菌：purnadpdx；受体菌：purnadpdx,选择基因,基

29、因型,菌落数,pur,nadpdx,nadpdx,nadpdx,nadpdx,3,10,24,13,数量最少的菌落基因型为：purnadpdx,供体菌：purnadpdx,受体菌：purnadpdx,基因的顺序为：,pur pdx nad,pur、nad并发转导频率 X10026,310,50,pur、pdx并发转导频率 X10054,324,50,、基因之间物理图距的计算,d=L(1-3 X),X（1d/L),3,X=两个基因合转导的频率,d=同一染色体上两基因之间的物理距离,L=转导DNA的平均长度91.5KB，2min遗传图距或2X2040遗传图距,例：课后14题，thr和leu相距2,

30、X（1d/L）（12/40%)=85.9%,3,3,、流产转导（abortive transduction）：指转导DNA分子进入受体细胞后，既不与受体基因组发生交换，又不随宿主DNA复制而复制，而是很稳定地存在于细胞之中，由于细菌不断增殖，故该转导类型的细菌所占比例越来越少，以至最终消失，故称为流产转导。,例：以P22为媒体的沙门氏菌的转导中，在基本培养基上除了正常大小的菌落外，还有一些微小的菌落。小菌落中的细胞能再产生一个原养型小菌落。,、局限转导,、概念：由温和噬菌体（如）介导的转导类型。原噬菌体离开细菌染色体时，偶尔可将噬菌体插入位点两边的细菌基因一起环落下来而形成混杂的DNA片段，该

31、DNA片段由噬菌体蛋白质衣壳包裹，再去侵染其他宿主细菌，可将特定的细菌基因带入新的受体菌，进而重组整合，这种转导称为局限性转导。,、转导噬菌体的形成,att,att,bio,gal,bio,gal,att,att,bio,gal,att,bio,gal,aat,pbio,dgal,、低频转导：用诱导溶原性菌株得来的噬菌体进行转导时转导频率不高，称为低频转导。,、高频转导（highfrequency transduction，HFT）：如果dgal与正常噬菌体同时感染一个受菌体，可诱导产生/dgal双重溶原菌。这种双重溶原菌不稳定，经紫外线诱导可产生大约半数的转导噬菌体。用这样得来的噬菌体进行的转导称为高频转导。,bio,gal,att,att,att,gal,gal,gal,att,att,bio,att,