第七章2转化转导结合菌种包藏.ppt

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1、三、微生物突变的应用：自发突变育种 生产育种:选育正向突变的优良的品种 定向培育(卡介苗BCG):积累并选择相应的自发突变株诱变育种 用物理（X-ray、UV等）化学（吖啶、亚硝酸、碱基类似物）因素诱变育种，获得突变机率提高。,Ames test：对化学诱变剂做检测,菌种：鼠伤寒沙门氏菌his-；原理：his-在基本培养基上不长；而发生回复突变则长。,Ames test 方法示意图,第三节 基因重组,定义：凡把两个不同性状个体内的遗传基因转移到一起，经过遗传分子间的重新组合，形成新遗传型个体的方式，称为基因重组（gene recombination）或遗传重组。,重组与杂交的关系：重组是分子水

2、平上的一个概念，可以理解成是遗传物质分子水平上的杂交而一般所说的杂交（hybridization）则是细胞水平上的一个概念。,作用：重组可使生物体在未发生突变的情况下，也能产生新遗传型的个体。,基因重组的意义,基因重组是杂交育种的理论基础。杂交育种的优点：由于杂交育种选用了已知性状的供体菌和受体菌作为亲本，因此，不论在方向性还是自觉性方面，均比诱变育种前进了一大步。利用杂交育种往往还可以消除某一菌株在经过长期诱变处理后所出现的产量上升缓慢的现象，因此，它是一种重要的育种手段。杂交育种的缺点：由于杂交育种的方法较复杂，工作进展较慢，还很难像诱变育种技术那样得到普遍的推广和使用，尤其在原核生物的领

3、域中，应用转化、转导或接合等重组技术来培育可应用于生产实践上的高产菌株的例子还不多见。到了70年代后期，由于原生质体融合技术获得巨大的成功后，才使重组育种技术获得了飞速的发展。,甲生长快、产量低,乙生长慢、产量高,基因重组,如：,生长快、产量高,一、原核微生物的基因重组,基因重组的方式：转化转导接合原生质体融合,R型活菌+S型死菌 S型活菌定义：受体菌自然或在人工技术作用下直接摄取来自供体菌的游离DNA片段，并把它整合到自己的基因组中，而获得部分新的遗传性状的基因转移过程，称为转化。转化后的的受体菌称为转化子（transformant）。,（一）转化（transformation）,1、转化及

4、其发现：,有关名词：受体菌：转化基因的接受者供体菌：转化基因的提供者转化因子：来自供体菌的DNA片段转化子：将转化基因重组进入自身染色体组的重组子,受体细胞要处于感受态.感受态：受体细胞能从环境吸取外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态；供体DNA片段大小适宜，分子量一般为1 107 D 左右；菌株间的亲缘关系密切。,2、转化发生的条件：,感受态：,出现时间：只在细菌生长的某一时期出现；不同菌种的感受态出现在不同生长时期Streptococcus pneumoniae的感受态出现在生长曲线中的指数期的中期，Bacillus的一些种则往往出现在指数期末及稳定期的初期。感受态细胞的比例：当处于感

5、受态高峰时，群体中呈感受态的细胞因菌种而不同.Bacillus subtilis不超过1015%Streptococcus pneumonia和Haemophilus influenzae（流感嗜血杆菌）达到100%转化DNA的最低浓度：在群体中含有15%感受态细胞时，0.1gDNA/ml细胞悬液即可有效发生转化,感受态因子：细胞外蛋白，Streptococcus pneumonia和Bacillus中分离的分子量为5,00010,000Dalton，可能存在于细胞膜上，可催化外来DNA分子的吸收或降解细胞表面某种成分，以让细胞表面的DNA受体显露出来；也可能是一种自溶酶。对不同细菌，每个细胞

6、上的DNA结合位点数不同。有人计算，在H.Influenzae上有410个，而在S.Pneumonia上则有3080个。S.Pneumonia的感受态细胞中提取的感受态因子可使同菌株的非感受态细胞变成感受态的，而Bacillus subtilis的感受态因子则无此功能。,转化因子：,转化因子：本质是供体DNA片段一般的转化因子都是线状双链DNA；也有少数报道认为线状单链DNA也有转化作用。大小：经过多次提纯操作后，每一转化DNA片段的分子量都小于1107，即约占细菌核染色体组的0.3%，其上平均约含15个基因。而粗制的DNA则分子量较大。吸收数量：每个感受态细胞约可掺入10个转化因子。转化频率

7、：一般只有0.11%，最高时亦达10%左右。据研究，呈质粒形式（双链闭合环状）的转化因子，其转化频率最高（因为它进入受体菌中后，可不必与受体染色体进行交换、整合即可进行复制和表达）；。,3、转化的类型：,根据感受态建立的方式，可以分为：自然遗传转化人工转化,自然转化,到目前为止，已发现能发生转化作用的菌属主要有：Streptococcus pneumoniae、Haemophilus（嗜血杆菌属）、Bacillus、Neisseria（奈瑟氏球菌属）、Rhizobium（根瘤菌属）、Staphylococcus、Pseudomonas和Xanthomonas中多见。在若干放线菌和蓝细菌以及粗糙

8、脉胞菌中，也有转化现象。肠杆菌科的一些细菌很难进行转化，主要原因一方面由于外来DNA难以掺入到细胞中，另一方面在受体细胞内常存在可降解线形DNA的核酸酶。如果用CaCl2处理E.coli的球状体，就可以使之发生低频率的转化。另外，可利用霉菌的原生质体进行转化。,.转化的过程,以S.Pneumonia strr（肺炎链球菌抗链霉素菌株）为例，大致可分为六阶段：吸附：双链DNA片段与细胞表面的特定位点结合，此时，细胞膜上的胆碱可促进这一过程。切割：在吸附位点上的DNA被核酸内切酶分解，形成平均分子量为45106的DNA片段；入胞：DNA双链中的一条单链被膜上的另一种核酸酶切除，另一条单链逐步进入细

9、胞，这是一个耗能的过程。分子量小于5105的DNA片段不能进入细胞。这时如用低浓度溶菌酶处理，因它提高了细胞壁的通透性，故可提高转化频率；重组：来自供体菌的单链DNA片段在细胞内与受体细胞核染色体组上的同源区配对，交换、整合和取代，于是形成了一个杂合DNA区段。在这一过程中，有核酸酶、DNA聚合酶和DNA连接酶的参与；复制：受体菌的染色体组进行复制，杂合区段分离成两个，其中之一获得了供体菌的转化基因，另一个未获供体基因；转化子形成：当细胞发生分裂后，一个子细胞含供体基因，这就是转化子；另一个细胞与原始受体菌一样。,降解,吸附,切割成45106,单链入胞,同源部分配对、整合,复制分裂，只有一个子

10、代DNA分子获得供体基因,转化的过程,strr,strr,人工转化,人工转化是通过人为诱导的方法，使细胞具有摄取DNA的能力，或人工地将DNA导入细胞内。方法：CaCl2处理细胞，使其成为能摄取外源DNA的感受态状态.电穿孔法electroporation：用高压脉冲电流击破细胞膜，或击成小孔，使各种大分子（包括DNA）能通过这些小孔进入细胞。,可转化的形状：,荚膜多糖的合成专一性酶的合成专一性蛋白质的合成抗药性,定义：把噬菌体或其它病毒的DNA（或RNA）抽提出来，让它去感染感受态的宿主细胞，并进而产生正常的噬菌体或病毒的后代，这种现象称为转染。与转化的区别：病毒或噬菌体并非遗传基因的供体菌

11、中间不发生任何遗传因子的交换或整合最后不产生具有杂种性质的转化子,4.转染,（二）接合（conjugation）,定义：供体菌（“雄”）通过其性菌毛与受体菌（“雌”）相接触，前者传递不同长度的DNA给后者，并在后者细胞中进行双链化或进一步与核染色体发生交换、整合，从而使后者获得供体菌的遗传性状的现象，称为接合。通过接合而获得新性状的受体细胞就是接合子（conjugant）存在范围：细菌：G 较为多见如E.coli、Salmonella、Shigella、Serratia、Vibrio、Azotobacter、Klebsiella和Pseudomonas等最为常见放线菌：Streptomyces

12、、Nocardia接合还可发生在不同属的菌种之间，,接合两个亲本细胞通过直接接触来转移遗传物质的基因重组方式。通过接合而获得新性状的受体细胞就是接合子（conjugant）。,1、接合及其发现,A,B,研究细菌接合方法的基本原理,接合：供体与受体细胞直接接触，借性菌毛传递DNA，在受体细胞中发生交换、整合，使之获得供体菌的遗传性状的现象，称为接合。通过接合而获得新性状的受体细胞就称接合子。,2.根据F因子在E.coli中的有无，及与染色体的关系，可将E.coli分为四种类型：,F（“雌性”）菌株：细胞中不含有F因子，细胞表面不具有有性纤毛。F+（“雄性”）菌株：细胞内含有（14个）游离的F因子

13、，细胞表面存在与F因子数目相当的性菌毛。,Hfr菌株（高频重组，high frequency recombination）：含有与染色体特定位点整合的F因子。因该菌株与F 接合后的重组频率比F+菌株高几百倍而得名。Hfr菌株与F菌株接合时，Hfr染色体双链中的一条单链在F因子处发生断裂，F因子位于线状单链DNA的两端，整段单链线状染色体从5端开始等速进入F细胞，在没有外界干扰的情况下，全部转移过程的完成需要约120分钟。由于种种原因DNA转移过程常会发生中断，所以越是前端的基因进入F 细胞的机会越大。F因子位于线状DNA的末端，进入受体细胞的机会最小，故这种接合引起转性的频率最低，但可以出现各

14、种重组子。,F菌株：细胞中含有游离的、带小段染色体基因的环状F因子，可与F 菌株接合，使其成为F菌株。F菌株的形成：由Hfr菌株中的F因子在不正常切离而脱离核染色体组时所形成，并因此造成细胞染色体发生缺失，F因子也缺失一段DNA.F因子转导:利用F菌株与F接合可将供体染色体DNA传入F 菌株，从而使F 既获得供体菌的若干遗传特性，又可获得F因子。这种接合方式叫做F因子转导,又称性导.因为F因子可在细菌的染色体多位点整合，所以F因子转导可实现不同基因的转移和重组。,F 因子的存在方式及其相互关系,接合的一般过程：,接合时F+细胞与F 细胞相遇，性菌毛与F 细胞表面发生吸附而形成接合管；F+细胞内

15、，F因子的一条DNA单链在特定的位点上发生断裂；断裂后的单链逐步解开，同时以另一条留存的环状单链做模板，通过模板的滚动，一方面把解开的单链以5为先导通过性菌毛推入F 细胞中，另一方面，在供体细胞内以滚动的环状模板重新合成一条互补的环状单链，以取代传递到F 细胞中的那条单链。这种DNA复制机制称为滚环模型；在F 细胞中，以外来的供体DNA线状单链为模板合成一条互补单链，并随之恢复成环状双链F因子。至此，原来的F 菌株变成了F+菌株。原来的供体仍为F+菌株。,细菌染色体,质粒,质粒转移,质粒整合,F质粒的接合转移,F+xF-=2F+,Hfr x F-=Hfr+F-,3.重组结果：,F F F+F,

16、三、转导（transduction）,1.转导及其发现,1.定义：以温和噬菌体为媒介，将供体细胞的DNA片段携带到受体细胞中，通过交换与整合，从而使后者获得前者部分遗传性状的现象，称为转导。,噬菌体裂解第一个宿主时可能有三种情况：1）包入的完全是噬菌体的DNA（正常噬菌体）2）包入的完全是细菌DNA（完全缺陷噬菌体）3）部分带有噬菌体基因的DNA（部分缺陷噬菌体）,2.转导的种类,完全普遍转导 普遍转导 流产普遍转导 转导 低频转导 局限转导 高频转导,(1)普遍转导(generalized transduction)噬菌体可误包供体菌中的任何基因(包括质粒)，使受体菌实现各种性状的转导.完全

17、普遍 性转导 能形成遗 传性稳定 的转导子,裂解循环,(2)流产转导(abortive transduction):在许多获得供体菌DNA片段的受体菌内，如果转导DNA不能进行重组和复制，其上的基因仅经过转录而得到表达。能在选择性 培养基平板 上形成微小 菌落是流产 转导的特点。,(3)局限转导(也称专性转导):某些温和噬菌体只能将细菌的少数特定基因转移到受体菌中的现象。当溶原菌经诱导后，其中极少数前噬菌体从宿主染色体脱落时产主错误切割，从而把宿主的某些基因（前噬菌体位点两端是细菌染色体的gal和bio），故形成的转导噬菌体通常带有ga1或bio基因，当这样的噬菌体侵染另一宿主细菌时，噬菌体

18、DNA 与受体菌的 DNA 同源区段配对，通过双交换而整合到受体菌的染色体上，使受体菌获得了供体菌的这部分遗传特性，而形成了专性转导子。,噬菌体DNA的不正常切割,缺陷噬菌体（defective phage）:丢失了自身部分基因，并被同等长度的宿主基因所取代的噬菌体称为缺陷噬菌体。如dgal或dbio。低频转导（low frequancy transduction,LFT）:形成转导子频率很低的转导，通常只有10-4 10-6。高频转导（high frequancy transduction,HFT）:形成转导子的频率很高,理论上可达 50%。,(4)溶源转变(lysonenic conver

19、sion)当温和噬菌体感染其宿主而使之发生溶源化时，因噬菌体的基因整合到宿主的基因组上，而使后者获得了除免疫性以外的新性状的现象。当宿主丧失这一噬菌体时，通过溶源转变而获得的性状也同时消失。溶源转变与转导有本质上的不同，首先是它的温和噬菌体不携带任何供体菌的基因；其次，这种噬菌体是完整的，而不是缺陷的。溶源转变的典型例子是不产毒素的白喉棒杆菌(Corynebacterium diphtheriae)菌株在被噬菌体感染而发生溶源化时，会变成产白喉毒素的致病菌株。,普遍性转导和局限性转导的比较,4.原生质体融合 通过人工的方法，使遗传性状不同的两细胞的原生质体发生融合并产生重组体的过程称为原生质体

20、融合（protoplast fusion）。,原生质体融合操作过程,第四节 真菌的基因重组 一、有性生殖,粗糙脉孢菌的子囊孢子在子囊中的排列有六种方式,AAAAaaaa aaaaAAAA AAaaAAaa aaAAaaAA AAaaaaAA aaAAAAaa,接合型基因座(A或a)与着丝粒之间未发生染色体交换,接合型基因座(A或a)与着丝粒之间发生了染色体交换,二、准性生殖 1.定义：它可使同种生物不同菌株的体细胞发生融合，不经过减数分裂的方式而导致低频率的基因重组并产生重组子。体细胞中染色体交换有丝分裂交换：双倍体杂合子遗传性状不稳定，进行有丝裂过程中，极少数核中染色体会发生交换和单倍体化，

21、而形成具有新性状的 单倍体杂合子。2.准性生殖过程:菌丝联结异核体形成核配体细胞交换和 单倍体化四个 阶段。,在准性生殖中,有丝分裂产生非整倍体核,非整倍体核在继续分裂中丢失染色体,导致重组单倍体的发生,3.准性杂交主要步骤：1、选择亲本：要有选择性标记。2、强制形成异核体。3、移单菌落。4、检验稳定性。5、促进变异。然后筛选。,第五节 菌种的衰退、复壮和保藏,一、菌种的衰退、复壮,二、菌种的保藏,(一)衰退与复壮的概念 衰退（degeneration）：由于自发突变的结果，而使某物种原有一系列生物学性状发生质变或量变的现象。复壮(rejuvenation)：狭义的复壮是指在菌种已发生衰退的情

22、况下，通过纯种分离和生产性能测定等方法，从衰退的群体中找出未衰退的个体，以达到恢复该菌原有典型性状的措施；广义的复壮：是指在菌种的生产性能未衰退前就有意识的经常、进行纯种的分离和生产性能测定工作，以期菌种的生产性能逐步提高。实际上是利用自发突变（正变）不断地从生产中选种。,一、菌种的衰退、复壮,（二）防止菌种衰退的方法,1.控制传代的次数（一般在DNA的复制过程中，碱基的错配率是5x10-4，自发突变的频率为10-610-9，采用良好的菌种保藏方法，可以减少移种和传代的次数）2.创造良好的培养条件3.利用不易衰退的细胞传代：对丝状微生物而言，通常采用稳定的单核孢子进行接种。4.采用有效的菌种保

23、藏方法,（三）菌种的复壮措施,1.纯种分离 菌落纯的分离方法（平板表面涂布法，平板划线分离法，琼脂培养基浇注法）细胞纯的分离方法（分离小室进行单细胞分离，显微操纵器进行单细胞分离，菌丝尖端切割法进行单细胞分离）2.通过宿主体内生长进行复壮（如Bacillus thuringiensis的复壮）3.淘汰已衰退的个体（采用比较激烈的理化条件进行处理，以杀死生命力较差的已衰退个体）,二、菌种的保藏,1.菌种保藏机构的任务：广泛收集实验室和生产菌种、菌株（包括病毒株以及动、植物细胞株和质粒等）的基础上，使之达到不死、不衰、不乱以及便于研究、交换和使用的目的。常用的菌种保藏机构：中国微生物菌种保藏委员会

24、(CCCCM)美国的典型菌种保藏中心(ATCC),2.菌种保藏的原理,挑选典型菌种的优良纯种 一般采用微生物的休眠体（如孢子、芽孢等）,创造适于微生物长时期休眠的环境条件（如干燥、低温、缺氧、避光、缺乏营养以及添加保护剂或酸碱中和剂等）使微生物代谢速率极为缓慢或处于休眠状态,3.菌种保藏的方法,菌种保藏方法,生活态,休眠态,传代培养保藏法,连续在培养基上（内）移种,连续在活宿主上（内）移种,湿法,干法,固体斜面,半固体琼脂柱,液体介质（蒸馏水、甘油、糖液、其它溶液）,藏在玻璃管内,吸附在合适的载体上,藏在玻璃管内,吸附在合适的载体上,滴入小试管（在放入大试管干燥器中）,封入安培瓶 菌液直接真空

25、干燥法（L-干燥法）,冷冻真空干燥法,细粒状载体,球块状载体,有机基质,薄片状载体,（土壤、沙粒、土壤+沙粒）,（硅胶、瓷球）,（曲料、麦粒）,（滤纸片、,明胶小片、,血清蛋白小片）,干 法,具体常用的菌种保藏方法：（1）斜面传代保藏：定期传代，防止死亡。（2）干燥法：A、沙土管法，保藏细菌芽胞可用此法。B、麸夫管法，保藏霉菌、放线菌孢子可用此方法。（3）冷冻法：A、冷冻干燥法，适于多种微生物，特别是细菌。B、液N保鲜法（-196），适于不生孢子的丝状真菌。C、-70低温保藏，需超低温冰箱。（4）悬液法：将微生物细胞悬浮在水、甘油、蔗糖液、葡萄糖液、盐水、磷酸缓冲液中，某些细菌、酵母用此法可保

26、藏几年至近十年。,几种常用菌种保藏方法的比较,本章重点：1.质粒（定义、类型、作用）2.突变体的类型:（营养缺陷型、抗性突变体）定义及其筛选方法。3.原核微生物的基因重组方式（定义及其结果）转化、结合、转导、原生质体融合。,1.已知DNA的碱基序列为CATCATCAT，什么类型的突变可使其突变 为：CTCATCAT(A)A.缺 失 B.插 入 C.颠 换 D.转 换2.不需要细胞与细胞之间接触的基因重组类型有(B)：A.接 合 和 转 化 B.转 导 和 转 化C.接 合 和 转 导 D.接 合3.转导噬菌体（B）A.仅含有噬菌体DNA B.可含有噬菌体和细菌DNA C.仅含有细菌DNA4.在

27、Hfr菌株中(A)：A.F因子插入在染色体中 B.在接合过程中，F因子首先转移C.在接合过程中，质粒自我复制,5.F+F-杂 交 时，以下哪个表述是错误的（B）A.F-细胞转变为F+细胞 B.F+细 胞 转 变 为 F-细 胞C.染色体基因不转移 D.细胞与细胞间的接触是必须的6.当F+F-杂 交 时(B)A.F因子几乎总不转移到F+细胞中B.F-菌株几乎总是成为 F+C.基因重组的发生频率较高D.F因子经常插入到F-细胞染色体上7.转导子是指(D)：A.供体菌 B.转导噬菌体 C.转 导 前 供 体 菌 D.转 导 后 受 体 菌,营 养 缺 陷 型 野 生 型 菌 株 Hfr 菌 株F+菌 株 什 么 叫 转 导？试 比 较 普 遍 性 转 导 与 局 限 性 转 导 的 异 同。2.试 述 筛 选 营 养 缺 陷 型 菌 株 的 方 法，并 说 明 营 养 缺 陷 型 菌 株 在 应 用 上 的 作 用3.什 么 是 基 因 重 组，在 原 核 微 生 物 中 哪 些 方 式 可 引 起 基 因 重 组 4.什么是原生质体融合，其步骤有哪些.,