第七章放线菌遗传.ppt
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1、第七章:放线菌遗传,在放线菌遗传学研究中,以链霉菌属(Streptomyces)为主要研究对象。链霉菌属是革兰阳性、多细胞、丝状土壤细菌。具有复杂的形态分化周期,包括孢子萌发产生分枝状的基质菌丝,基质菌丝再发育成气生菌丝和孢子。链霉菌属的最显著特征是产生广泛的、具有重要价值的次级代谢产物:如抗生素、水解酶、酶的抑制剂、免疫调节剂和色素等。,在自然界已发现的近万种抗生素中,约70是由链霉菌产生的,如链霉素、红霉素、四环素、利福霉素、多氧霉素、阿维菌素、井冈霉素等,这些抗生素已广泛用于医药、农业和畜牧业。,1955年塞蒙梯(Semonti)夫妇首先发现天蓝色链霉菌Streptomyces coel
2、icolor A3(2)可通过遗传交换产生重组体。(Hopwood)也在 S.coelor A3(2)菌株中证实了这一重组作用。20世纪70年代早期,所有研究都集中在描述遗传特征和染色体特性上,19731978年研究重点转移到放线菌的性别体系和遗传重组方面。同期,还利用遗传方法对抗生素合成、形态分化、噬菌体等开展了全方位的研究。20世纪80年代,将重组DNA技术和原生质体融合技术应用在该属的研究中。20世纪90年代,用分子生物学方法开展了对放线菌的基因组、形态分化的分子机制等方面的研究。,放线菌遗传的研究历程:,光学显微镜和电镜观察表明,像其他细菌的染色体一样,天蓝色链霉菌A3(2)的染色体
3、DNA在细胞中以致密的、拟核状态存在。链霉菌的染色体DNA也是形成许多超螺旋区域,并与蛋白质和RNA分子结合在一起。染色体在菌丝中以多拷贝形式存在,而在孢子中以单拷贝形式存在。,第一节 链霉菌的染色体,一、链霉菌的染色体DNA,以前,一直认为链霉菌的染色体与大肠杆菌一样是环状染色体。自从1993年用脉冲电泳(PFGE)和酶切物理图谱等研究方法,首次证明变铅青链霉菌(S.1ividans)的染色体是线性而非环状以来,越来越多的研究证据表明:几乎所有链霉菌的染色体都为线性而非环状,链霉菌只有一条染色体,基因内部无内含子。染色体大约均为 8Mb,几乎是大肠杆菌染色体的2倍,少数链霉菌的染色体小于8M
4、b。链霉菌基因组G+C含量为7375,重复DNA序列为4-11。,线性染色体具有两个特征:1、染色体的两个末端具有长度为24-600kb的反向重复序列,简称TIR(terminal inverted repeat)。如:天蓝色链霉菌的TIR为61kb 变铅青链霉菌的TIR为30kb 灰色链霉菌(S.grlseus)的TIR为24kb2、每个DNA链的5末端都有共价结合蛋白,简称 TP(terminal protein)。,天蓝色链链菌A3 M145菌株基因组全长8,667,507bp,含有7825个编码基因,是迄今为止拥有最多基因的细菌。其中调控基因有965个,占整个基因组的12.3%。编码次
5、级代谢产物(包括抗生素)合成酶基因大约占基因组的5%,平均每个基因编码区的长度为1.14kb。天蓝色链霉菌A3 M145和变青铅链霉菌的染色体中央有复制起点oriC,一般认为链霉菌素线性染色体的复制通过oriC复制原点进行双向复制,末端蛋白作为引物(TP-primesed)引导染色体末端及冈崎片段的合成。,1997年8月英国开始了对天蓝色链霉菌A3(2)M145菌株的基因组进行全序列测定,并于2002年全部完成。,遗传不稳定性是链链菌的主要特征之一,这与其较大的线性染色体直接相关。链霉菌线性染色体和质粒具有相似的结构,一般分为核心区和两臂区。核心区是遗传相对稳定区域,生命活动的必需基因均位于此
6、。两臂区位于染色体的两个线性末端,长度有一定差异,富含小的回文重复序列,5-端与蛋白质共价结合,并受其保护。线性染色体末端容易丢失,有时可达2Mb(占整个基因组的1/4),失去部分末端序列并不影响链霉菌的生长,但影响次生代谢,如气生菌丝及孢子形成、抗生素、色素的生成。,链霉菌的染色体具有高度的遗传不稳定性,常发生缺失和扩增,引起染色体重排。染色体缺失的范围可高达2000kb以上。染色体扩增是指某些染色体DNA序列的拷贝数专一地大量增加的现象。在描述染色体扩增时常用到AUD和ADS术语:AUD(amplified unit of DNA)是指扩增单位,来定义DNA扩增的区域,AUD的长度为525
7、kb,两侧是12kb的重复序列。ADS(amplified DNA sequence)是用来定义扩增的 DNA序列,是扩增单位通过串联重复而形成。,二、链霉菌染色体的缺失、扩增和重排,在基因扩增的突变体中,扩增的DNA序列(ADS)很容易检测,因为在染色体酶切电泳图谱中,ADS呈很强的带型。在有些突变体中,ADS是染色体的重要组成成分,含量可高达染色体DNA的30。链霉菌染色体的缺失和扩增引起的自发突变可高达0.1一1,用UV照射或生长过程中加入溴化乙锭后,突变率可达10甚至更高。,在变铅青链霉菌66和天蓝色链霉菌A3(2)中,最常发生缺失的染色体片段是位于染色体末端的氯霉素抗性基因。末端的氯
8、霉素抗性基因缺失后,缺失末端重组而环化形成环状染色体,因此许多氯霉素敏感突变株具有环状的染色体末端。在变铅青链霉菌中,约有0.5的氯霉素敏感突变株Cmls,这种突变株表现更不稳定,约以25的频率突变为精氨酸缺陷型(Arg-),这种缺陷型是由于编码精氨酰琥珀酸合成酶argG(argininosuecinate synthetase)的基因缺失造成的。,1.变铅青链霉菌的氯霉素和精氨酸(CmlsArg-)双突变株,Cmls Arg-双突变株携带着AUD1。,AUD1是由1kb-4.7kb-4.7kb-1kb组成。AUD1位于距离线性染色体的末端约800kb。在Cmls Arg-双突变株中,与 AU
9、D1一起被扩增的还有AUD2,AUD2距离染色体末端约300kb。AUD2携带编码汞离子抗性的基因,大小为70kb。,灰色链霉菌2247的染色体是7.8Mb的线性染色体。A因子(A factor)是一种细菌激素,对链霉素(Strepotmycin)的产生和孢子形成起着正调节作用,afsA基因产物是A因子生物合成的一个关键酶。afsA基因距离染色体左末端150kb。afsA基因在高温条件下培养或用UV照射后,以高频率丢失。通过亚硝基胍(NTG)和高温诱变获得了2个afsA-突变株,对这2个突变株进行分子生物学鉴定,发现突变株的染色体(包括afsA位点)发生了缺失:A突变株的染色体左末端180kb
10、和右末端20kb缺失 B突变株的染色体左末端350kb和右末端130kb缺失,2.灰色链霉菌染色体缺失使afsA位点丢失,这2个突变株的缺失染色体都再环化形成环状染色体。对环状染色体的接头(junction)进行克隆和序列分析,并与亲本菌株进行比较。发现接头处并无大范围的同源区,而只有6bp的小同源区,说明染色体的环化是由于非同源重组引起的,属于异常重组。环状染色体在这两个突变株中都能稳定存在。,产二素链霉菌遗传极不稳定,在培养过程或菌株保藏中,常发生变异。对不产色素的8个自发性突变株的研究发现,这些突变株的染色体都有不同程度的缺失,可将其归为3种类型:,3.产二素链霉菌(S.ambofaci
11、ens)中的缺失突变体,产二素链霉菌野生型菌株的染色体是8000kb的线性DNA,末端TIR的长度为210kb,与蛋白质共价结合。,对再环化后的子代染色体稳定性研究表明,环化后的染色体并不稳定,又进一步发生缺失。这说明缺失与染色体的环化无直接的相关性。2个扩增单位:AUD90和AUD6的长度分别为15kb和1.9kb。由于很多缺失突变体的缺失点位于AUD6附近,因此AUD6被称作染色体重排热点,缺失位于染色体一臂的近末端,包括部分TlR序列,但染色体仍呈线性。,染色体两端的TIR-L和TIR-R完全缺失,然后再环化形成环状染色体。,缺失发生在染色体的一端,并终止在扩增部位,即突变体同时具有缺失
12、和扩增,染色体仍呈线性。,野生型菌株中有一个8.0kb的AUD序列,该AUD含有对链霉素有微弱抗性的基因。在扩增突变体中,有200-300个拷贝的8.0kb AUD串联重复形成的扩增区域(ADS),对链霉素具有较强的抗性。伴随着基因扩增,位于ADS附近约10kb DNA的缺失。,4.不产色链霉菌红迪变种(S.achromogenes subsp.rubradiris)的染色体扩增,在弗氏链霉菌(S.fradiae)中,野生型菌株只有一个AUD,由8.3kb和两侧2.2kb正向重复序列组成。而在它的扩增突变体中,据DNA杂交的动力学表明,有500多个拷贝的10.5kbAUD,即扩增长度达到500
13、0kb。,缺失和扩增是链霉菌中的一种普遍现象。不稳定的结构基因常与染色体的扩增单位AUD相连而被缺失掉,缺失终止在ADS附近。链霉菌染色体重排主要有三种类型:线状染色体的两个末端都发生缺失,缺失末端重组后环化形成环状染色体;缺失和扩增只发生在染色体的一个末端,另一个末端保持完整,因此染色体仍是线状的;在染色体内部发生大范围的缺失,染色体的两个末端仍是完整的。,大多数链霉菌都含有质粒,几乎都是自主转移质粒,它们在链霉菌的接合过程中起着重要作用。少数质粒与抗生素的产生、形态分化等有关。链霉菌中的质粒,大小从4kb到600kb,拷贝数从几个到几百个,有线性和环状两种类型。(1)线性质粒 链霉菌中有很
14、多质粒在形态上是线性的,如SCPl、pSLA2等。链霉菌中的线性质粒与链毒菌的线性染色体一样,在DNA两端具有TIR和5末端蛋白。,第二节 链霉菌中的质粒、转座因子和噬菌体,一、链霉菌中的质粒,1.链霉菌中的质粒类型,(2)环状质粒:传统的共价、闭合、环状质粒(cccDNA),如:SCP2(31kb),其拷贝数低;pIJl01(8.9kb)质粒,具有300个拷贝。有些环状的链霉菌质粒具有像噬菌体那样,能特异性的整合到宿主染色体上。天蓝色链霉菌的SLP1(17kb)和产二素链霉菌的 pSAM2(11kb)就是这种类型的质粒。这些质粒正常情况下位于染色体上,当它们切离染色体后,通过接合作用能独立地
15、转移到不含这种质粒的菌株中。,自然条件下,链霉菌的遗传重组主要是通过自主转移质粒介导的接合作用而进行的。大多数链霉菌的自主转移质粒都具有致死接合反应的特征,在表型上产生“麻点”(pock)。麻点:指将含有自主转移质粒的菌株,接种到不含该质粒的菌株的“菌丝坪”上培养时,产生环状晕圈的现象。,2.质粒与致死接合反应(1ethal zygosis,lez+),这种现象最早在天蓝色链霉菌中发现,即当含有SCP2质粒的天蓝色链霉菌培养物影印到SCP2-菌株的“菌丝坪”上培养时,能产生环状晕圈,即麻点。,麻点的形成:是由于SCP2质粒转移到SCP2-菌株后,导致SCP2-菌株暂时发育迟缓而造成的,这种现象
16、也叫致死接合反应。研究表明,链霉菌所有的接合质粒,都能产生致死接合反应。通过接合作用在SCP2-是否产生麻点,就很容易鉴定链霉菌中的接合质粒。通过致死接合反应,已在其他链霉菌中发现了一系列接合质粒。,除SCP1外,大多数链霉菌的自主转移质粒都较小。如:pIJ101这样的小质粒,它本身含有自主转移机制能进行自我转移,而不依靠大质粒进行转移。为什么链霉菌中与接合作用有关的质粒一般都较小?这可能与链霉菌的接合方式有关,链霉菌细胞之间的接合不需要性菌毛,而大肠杆菌的接合作用则依赖于质粒编码的性菌毛的作用。大多数链霉菌的质粒的接合效率能达到100。,3.几种重要的自主转移质粒,1971年,通过遗传研究证
17、明,SCP1质粒控制着寄主天蓝色链霉菌的致育性,但由于它是一种巨大质粒,难于分离和进行深入研究。直到20世纪80年代末和90年代初,才对它的分子结构有了深入了解。,(1)天蓝色链霉菌SCP1质粒,SCP1:线性双链DNA、363kb,携带次甲基霉素生物合成基因。质粒DNA两端有长末端反向重复序列(TIR)。左末端重复序列(TIR-L)和右末端重复序列(TIR-R)长度均为80kb,而且TIR-R内侧含有插入因子IS466。,Sakaguchi等人提出的线性染色体或线性质粒的结构模型:SCP1的球拍框架(racket frame)结构,球拍柄是由染色体DNA的反向重复序列区域组成,这一结构的形成
18、是TIR及其结合蛋白的相互作用的结果。,SCP1 363kb,SCPl质粒具有下列特征:编码几种与产孢有关的蛋白质。携带合成次甲基霉素的基因簇。在天蓝色链霉菌中有下列几种存在形式:a.自主复制质粒(SCP1);b.整合到寄主染色体上的整合型(SCP1-NF);c.带有染色体片段的自主复制质粒(SCP1-cysB和 SCP1-argA uraB)。,UF:超致育型(Ultrafertility)F-IF:原始致育型(Initial Fertility)F+NF:正常致育型(Normal Fertility)Hfr,SCP2:是共价、闭合的环状双链DNA,31kb,拷贝数是1-2个/细胞。SCP2
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- 第七 放线菌 遗传
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