第二节 重组体导入受体细胞的原理与技术.ppt

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1、第二节 重组体导入受体细胞的原理与技术,一、重组DNA导入大肠杆菌的方法 二、重组DNA导入真核细胞的方法 三、转化率及影响因素,一、重组DNA导入大肠杆菌的方法,相关概念1.转化(transformation)细菌获得外源质粒DNA，产生新的遗传性状的过程。2.转导(transduction)以噬菌体为媒介，将外源DNA导入细菌的过程。3.转染(transfection)指感受态的受体细胞捕获和表达以噬菌体为载体的重组DNA分子的过程。转导和转染的区别转导：通过噬菌体（病毒）颗粒感染宿主细胞的途径把外源DNA转移到受体细胞的过程。转染：噬菌体DNA分子直接导入受体细胞的过程。,（一）转化（t

2、ransformation）,（1）热激法（heat shock）,（2）电转化法（electronporation）,（3）PEG介导的原生质体转化,（4）接合转化,一、重组DNA导入大肠杆菌的方法,1、化学转化法感受态：细菌能从周围环境中吸收DNA的生理状态称为感受态(competence).感受态的出现是由于细菌表面出现许多DNA结合位点，这些位点只能与双链DNA结合，而不与单链DNA结合。这说明完整的双链结构对于转化活性来说是必要的。对于大肠杆菌细胞，一般采用CaCl2溶液来处理受体细胞，增加细胞膜的通透性，制备感受态细胞。,一、重组DNA导入大肠杆菌的方法,一、重组DNA导入大肠杆菌

3、的方法,细菌感受态细胞的制备过程,培养大肠杆菌,OD600至0.3-0.4,On ice 5-10 min,4离心收集菌,用冰冷的60mMCaCl2重悬,4离心收集菌,4离心收集菌,分装、-70 冻存,用冰冷的60mMCaCl2重悬,On ice 30 min,用冰冷的60mMCaCl2重悬,一、重组DNA导入大肠杆菌的方法,重组体导入受体细胞,10ng载体DNA,100L感受态菌,On ice混合，静置30分钟,37摇1小时,10-100L转化液涂含抗菌素的平板,吸附DNA,摄入DNA,加入1mL LB培养基,42C 1.5分钟,热休克法,简单，但转化效率不高（106-108/gDNA）。,

4、一、重组DNA导入大肠杆菌的方法,平板培养基培养细菌,10-100L转化液,涂于含抗菌素的平板,37过夜,一、重组DNA导入大肠杆菌的方法,2.电击转化法 将待转化的质粒或DNA重组连接液加在电穿孔转化仪的样品池中，两极施加高压电场。在强大电场的作用下，细菌细胞壁和细胞膜产生缝隙，质粒或DNA重组分子便可进入细胞内 原理:用高压脉冲电流击破细胞膜或击成小孔，使各种大分子(包括DNA)通过这些小孔进入细胞.,转化效率高（高于109/gDNA）,一、重组DNA导入大肠杆菌的方法,LB培养受体菌至OD600=0.5-0.6,冰浴15分钟，2离心集菌,冰冷的水重悬菌体,2 离心集菌,冰冷的水重悬菌体,

5、2 离心收集菌体,少量冰冷的水重悬,分装成 50-300L,电转仪调为2.5kV,25F,脉冲控制器200-400,0.5g质粒DNA,On ice混合,加入1mLSOC培养液,37 中速震荡60分钟,10-100L转化液涂含抗菌素的平板,转化,电击转化法,（二）转导,由噬菌体和细胞病毒介导的遗传信息的转移过程,（三）转染,噬菌体DNA不经过蛋白包装成病毒颗粒，直接被感受态细胞捕获的过程。,与转化无本质区别,体外包装好的重组噬菌体感染受体菌，形成噬菌斑。每g DNA能形成106个噬菌斑,现在把DNA转移至动物细胞的过程也称转染,体外包装过程,二、重组DNA导入真核细胞,（一）导入酵母细胞,原生

6、质体转化碱金属离子介导的完整细胞转化PEG1000转化法电击法,（二）导入植物细胞,（三）导入动物细胞,1.利用原生质体进行转化,酵母,原生质体,感受态,酶去壁,CaCl2 PEG,插入外源基因的载体,转化,转化细胞达原生质体总数的1%2%，转化率受再生率影响共转化的原生质体占转化子总数的25%33%,酵母,0.1mol/L LiCl 处理,感受态,2.碱金属离子介导的完整细胞转化,热激,涂布选择性平板，筛选转化子,吸收线性DNA能力明显大于环状DNA，两者相差80倍转化率：103个/g DNA；共转化现象极少,4.电击转化,（1）适于原生质体和完整细胞（2）转化率高，105个/g DNA（3

7、）单链转化率高于双链,3.PEG1000转化,PEG处理酵母细胞，可获得类感受态，用于转化,二、重组DNA导入真核细胞,（一）导入酵母细胞,载体介导的转化（农杆菌介导）DNA直接导入（基因抢法、电击法等）种质系统法（花粉管通道法等）,（二）导入植物细胞,（三）导入动物细胞,（二）导入植物细胞,1.农杆菌介导的Ti质粒遗传转化方法,将目的基因插入到载体的T-DNA区，形成重组DNA,（二）导入植物细胞,1.农杆菌介导的Ti质粒遗传转化方法,将重组DNA转入含有Vir致病基因的农杆菌,（二）导入植物细胞,1.农杆菌介导的Ti质粒遗传转化方法,通过农杆菌侵染植物外植体,（二）导入植物细胞,1.农杆菌

8、介导的Ti质粒遗传转化方法,将含有外源目的基因的T-DNA整合到植物细胞基因组中，获得转基因植株,在饲养平皿的滤纸上培养2天,叶盘法的具体操作,又称生物弹击法、微弹轰击法，借助高速金属微粒将DNA分子引入活细胞的转化技术。,金属微粒加速，进入受体细胞,2.基因枪法（gene gun）,基因枪,具体操作,植物细胞,原生质体,纤维素酶和果胶酶,DNA,混合入电击缓冲液,电击处理,愈伤组织,幼苗,分化,3.电击法（电穿孔法）,选择培养,二、重组DNA导入真核细胞,（一）导入酵母细胞,1.磷酸钙沉淀法2.脂质体介导法3.显微注射法4.DEAE-葡萄糖转染法,（二）导入植物细胞,（三）导入动物细胞,原理

9、：,（三）导入动物细胞,1.磷酸钙沉淀法,通过磷酸钙-DNA共沉淀，将外源基因导入哺乳动物细胞,依据不同的细胞类型，平皿上最多能有10%的细胞能吸收DNA沉淀。,操作简便，成本低廉、可大批量转染、对细胞毒性小、效果稳定，但转染效率低。,2.脂质体介导法,脂质体包埋DNA，通过细胞膜进入细胞。,脂质体（lipofectin）载体法,应用玻璃显微注射器，直接把外源DNA注射到宿主细胞核里，使其整合到染色体上。,3.显微注射法,1）外源基因制备：线性化的质粒或目的片段2）收集受精卵：受孕后几小时内3）显微注射：将外源基因注入受精卵的雄原核4）受精卵移植,显微注射法(microinjection),二

10、乙氨乙基（DEAE）葡聚糖为多聚阳离子试剂，能促进哺乳动物细胞摄入外源DNA。,4.DEAE-葡萄糖转染法,葡聚糖,葡聚糖,DEAE-dextran,外源DNA,细胞,混合,DEAE-dextran对细胞有毒，常采用低浓度长时间处理,吸附到细胞表面后被细胞吞入，部分DNA可以进入到细胞核里。,4.DEAE-葡萄糖转染法,导入外源DNA的几种方法,三、转化率及影响因素,转化率（cfu/gDNA）：每微克重组DNA转化后，接纳DNA分子的受体细胞的个数，即阳性克隆数。,（一）转化率的计算：,转化率 产生菌落的总数/DNA的加入量,三、转化率及影响因素,例：取1l（0.1 ng/l）完整的质粒转化1

11、00l的感受态细胞。向转化反应液中加入900l培养液，让细菌恢复一小段时间，取100l铺板。培养过夜，产生1000个菌落，转化率为多少？,转化率1000/0.01 ng DNA=108 cfu/g,三、转化率及影响因素,例：某一DNA重组实验的重组率为20%，转化率为107 cfu/mg 天然载体，经酶切和连接处理后的重组载体转化率比天然载体约低100倍，欲获得104个重组克隆，需要投入多少重组载体DNA进行重组实验？,104 107 cfu/mg 10-2 a 20%重组载体 a=0.5 mg,三、转化率及影响因素,普通的亚克隆实验：110 6 cfu/g DNA；更复杂的亚克隆：1107 cfu/g DNA，如有限量的DNA的转化，T-A克隆；构建文库：1108 cfu/g DNA。,1）载体DNA类型、大小；重组DNA浓度、纯度2）受体细胞3）转化方法：同一转化方法技术参数影响转化率,（二）转化率的影响因素,三、转化率及影响因素,影响转化率的因素（2）感受态细胞（competent cells)生长状态制备 感受态菌必须使用对数生长期的菌。必须在冰冷的条件下制备。CaCl2处理 要充分，使细菌细胞膜失去一些蛋白。储存感受态菌要在-70以下 使用感受态菌时必须迅速融化 融化后一般不能再次冻存使用。,