第五章 植物细胞培养和次生代谢产物生产.ppt
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1、第五章植物细胞培养和次生代谢产物生产,第五章 植物细胞培养和次生代谢产物生产,主要内容:第一节 植物单细胞培养技术 第二节 植物细胞的大规模培养 第三节 植物细胞生物反应器 第四节 植物细胞培养生产次生代谢产物 学习的目标与要求:掌握单细胞分离和培养的方法,了解植物大规模培养方法,了解植物细胞生物反应器的设计与要求。了解利用植物细胞培养生产次生代谢产物的流程。,植物细胞培养和次生代谢产物生产,植物是人类赖以生存的食物和药品的重要来源之一。80%的天然产物来自于高等植物。资源的过度采掘,造成了许多植物资源的日益枯竭。通过植物细胞培养是弥补这方面的重要研究方向,植物细胞培养和次生代谢产物生产,红豆
2、杉惨遭剥皮,植物细胞培养和次生代谢产物生产,细胞产物的工厂化生产,植物细胞培养和次生代谢产物生产,什么是植物细胞培养?与组织培养的区别?植物细胞培养(plant cell culture):是指在离体条件下对植物单个细胞或小的细胞团进行培养并使其增殖,获得大量细胞群体的一种技术。1979年国际组织培养协会专业术语委员会建议:组织培养:从机体内取出组织或细胞,模拟机体内生理条件,在体外进行培养,使之生存或生长成组织。细胞培养:动植物细胞在体外条件下的存活或生长,此时细胞不再形成组织。,植物细胞培养和次生代谢产物生产,植物组织培养培养对象 植物的各种组织、器官培养目的 获得所需的植物组织和再生植株
3、;快速繁殖。,细胞培养培养对象各种形式的植物细胞培养目的获得所需的细胞和各种所需的产物;进行生物转化;将外源底物转化为所需的产物。,与植物组织培养的区别,植物细胞培养和次生代谢产物生产,植物细胞培养的应用获得的细胞群体可以作为制备有价值代谢产物的原料,也可以作为基础研究的材料。同时植物细胞培养技术也是人工种子、原生质体培养、花药培养等的支撑技术,植物细胞培养和次生代谢产物生产,与微生物相比,植物细胞的特点:细菌、真菌、植物细胞都有细胞壁细菌无成形的细胞核,真菌、植物细胞有成形的细胞核。细菌只有核糖体一种细胞器。植物细胞比微生物细胞大,植物细胞培养和次生代谢产物生产,植物细胞的特点:植物细胞直径
4、一般约会10-200微米,平均直径比微生物细胞大30-100倍。植物细胞很少以单一细胞形式悬浮生长,通常以一定细胞数的非均相细胞团方式存在。植物细胞具有纤维素细胞壁和大的液泡,很容易被剪切力损伤。与微生物细胞相比,植物细胞生长速度慢,操作周期长,分批培养一般需要2-3周,半连续或连续培养时间一般长达2-3个月植物细胞培养基成分丰富而复杂,适合微生物生长,因此防止污染更困难植物细胞培养一般需要光照,通过光合作用合成有机物,因此氧气和CO2的含量与传递对细胞培养影响较大。,植物细胞培养和次生代谢产物生产,植物细胞培养的方法 按培养规模:小规模培养和大规模培养 按培养方式:平板培养法、悬浮培养、看护
5、培养、微室培养等;按培养基类型:固体培养和液体培养 按要求产物:用于诱变的细胞培养和生产次生产物的细胞培养。,一、植物单细胞培养技术,固体培养:是在微生物培养基基础上发展起来的植物细胞培养方法。一般添加一定比例的琼脂起固化作用。固定化培养:属于固体培养,指将游离细胞包埋在多糖或多聚化合物制备的网状支持物中,培养液呈流动状态的无菌操作技术。液体培养:也是在微生物培养基础上发展起来的。可分为:振荡培养、旋转培养、静止培养、纸桥培养 细胞悬浮培养:属于液体培养,指植物细胞或小细胞团在液体培养基中大规模进行培养。,一、植物单细胞培养技术,振荡培养箱,一、植物单细胞培养技术,1.单细胞的分离 1)机械法
6、:指通过机械磨碎、切割植物体从而获得游离的单细胞。优点:细胞不受酶伤害。缺点:只适合于排列松散的薄壁细胞、效率低、产量少。1969年,Gnanam和Kulandaivelu用该方法分离出几种成熟叶片叶肉细胞。,一、植物单细胞培养技术,1.单细胞的分离机械法,第一种方法:用刀片刮叶片,一、植物单细胞培养技术,1.单细胞的分离机械法,第二种方法:叶片研碎、离心,一、植物单细胞培养技术,1.单细胞的分离 2)酶解法:指用专一的水解酶(纤维素酶、果胶酶、琼脂酶等)在温和条件下分解胞间层,分离细胞。优点:最有效的一种方法。缺点:成本较高,酶对细胞有一定伤害。1968年,Takebe等用该方法分离烟草叶肉
7、细胞成功。,一、植物单细胞培养技术,1.单细胞的分离,一、植物单细胞培养技术,机械法和酶解法比较,机械法,酶解法,细胞不受到酶的伤害;不用质壁分离;细胞产量低;细胞易破。,细胞受到酶的伤害;要质壁分离;细胞产量高;细胞不易破。,1.单细胞的分离,一、植物单细胞培养技术,1.单细胞的分离3)由培养组织分离单细胞:指将愈伤组织反复继代,再转移至液体培养基振荡培养。添加生长素或酶有利。这是分离单细胞通常采取的方法。诱导产生愈伤组织;愈伤组织反复继代,使组织不断增殖,提高愈伤组织的松散性;将愈伤组织在液体培养基中培养,建立悬浮培养物,外植体,连续继代培养愈伤组织,筛选未分化和易散碎的愈伤组织,振荡培养
8、,过滤和离心,理想的细胞悬浮液,建立单细胞悬浮液的程序,诱导和筛选愈伤组织,促使细胞游离,获得单细胞,一、植物单细胞培养技术,1.单细胞的分离愈伤组织诱导法,一、植物单细胞培养技术,建立悬浮细胞培养系,一、植物单细胞培养技术,2.单细胞培养技术1)平板培养法指将一定量细胞接种到或混合到一薄层固体培养基里进行培养的方法。此法是Bergman(贝格曼,1960)首创。平板培养的优点是便于在显微镜下对细胞进行定点观察,选择单细胞株和筛选突变体。,一、植物单细胞培养技术,2.单细胞培养技术 1)平板培养法 a.步骤 制备单细胞悬浮液 调制悬浮培养液中的细胞密度 倾倒平板(植板)密封、标记和培养 b.优
9、劣 平板培养法的优点在于单细胞在培养基中分布较为均匀,也便于定点观察,缺点是容易造成培养细胞的通气不良。,一、植物单细胞培养技术,平板培养法,2.单细胞培养技术1)平板培养法,一、植物单细胞培养技术,2.单细胞培养技术1)平板培养法 平板培养的效果一般用植板率来衡量。植板率是能长出细胞团的单细胞在接种单细胞总和中所占的比例。每个平板形成的细胞团数植板率 每个平板接种的细胞总数,一、植物单细胞培养技术,2.单细胞培养技术2)看护培养与饲养层培养法看护培养:是指用一块活跃生长的愈伤组织来促进培养细胞持续分裂和增殖的培养方法。谬尔(Muir,1953)首创此法。该方法的优点是简便易行,效果好。但不能
10、在显微镜下追踪细胞分裂、生长过程。饲养层培养:是用处理过的、无活性或分裂慢的细胞来饲养所需培养的细胞,使其分裂和生长。饲养层培养具体方法有四种:饲养细胞与靶细胞混合。前者位于下层,后者相反。一起培养于液体培养基中。双层滤纸植板培养,一、植物单细胞培养技术,2.单细胞培养技术,2.单细胞培养技术,一、植物单细胞培养技术,一、植物单细胞培养技术,2.单细胞培养技术3)液体浅层静置培养法指将一定密度的悬浮细胞放在培养皿中形成一浅薄层,封口静止培养。该方法优点:易于补加新鲜培养基,便于镜检。,一、植物单细胞培养技术,2.单细胞培养技术,一、植物单细胞培养技术,2.单细胞培养技术4)细胞悬浮培养法指将细
11、胞接种于液体培养基中,在保持良好的分散状态下培养。优点:能大量提供比较均匀的细胞。细胞营养吸收、环境条件好,细胞增殖快。适合大规模培养,生产有价值的活性代谢产物。,必须指出,悬浮培养中既有单细胞,也有细胞团。,一、植物单细胞培养技术,2.单细胞培养技术5)微室培养是指在人工制造的无菌小室中,将一滴悬浮细胞液培养在少量培养基上,使其分裂增殖形成细胞团的方法。此法是De Ropp(戴洛普,1955)首创,Torry(托瑞,1957)、Jones(琼斯,1960)改进。优点是便于在显微镜下进行少量单细胞活体连续观察。,一、植物单细胞培养技术,2.单细胞培养技术微室培养,一、植物单细胞培养技术,2.单
12、细胞培养技术微室培养,一、植物单细胞培养技术,2.单细胞培养技术微室培养,1滴含单细胞培养液,周围加石蜡油,凹穴载玻片,旁边加石蜡油,盖盖玻片,盖盖玻片,平视图,微室培养要求:微室内不能有气泡。微室的厚度最好不要超过20微米,盖玻片的厚度要在0.17-0.18mm左右。观察时要保持温度和培养时一致。,二、植物细胞的大规模培养,悬浮培养固定化培养,二、植物细胞的大规模培养,1.植物细胞的悬浮培养 植物细胞大规模悬浮培养的优点 1)可以增加培养细胞与培养液的接触面,促进营养吸收。2)可带走培养物产生的有害代谢产物,避免高浓度积聚对细胞的伤害。3)保证良好的混合状态,从而获得良好的气体传递效果,二、
13、植物细胞的大规模培养,5,S形曲线,滞后期,对数生长期,直线生长期,缓慢期,静止期,1,2,3,4,5,二、植物细胞的大规模培养,1.植物细胞的悬浮培养 1)细胞悬浮培养技术 成批培养:又称分批培养,指在一个固定容积的培养基中培养细胞,当培养基中主要的营养物质耗尽时生长就停止。连续培养:在培养过程中由于不断注入新鲜培养基,故培养液中营养物质能够连续得到补充,培养物的容积一般是恒定的。半连续培养:指新鲜培养液不是连续加入,而是在隔一定时间后把培养液倒出部分,同时再加入新鲜培养液。这相当于成批培养频繁地进行再培养。,二、植物细胞的大规模培养,1.植物细胞的悬浮培养 2)悬浮细胞培养的同步化方法同步
14、化是指同一悬浮培养体系的所有细胞都同时通过细胞周期的某一特定时期,使细胞保持相对一致的细胞学和生理学状态,便于研究细胞分裂和细胞代谢。物理方法:(1)体积选择法:又称分选法;(2)冷处理法 化学法:(1)饥饿法;(2)抑制法;(3)不连续密度梯度离心法,二、植物细胞的大规模培养,1.植物细胞的悬浮培养3)悬浮培养中细胞生长量的计算 细胞计数法:用血球计数板,以cells/ml表示。细胞体积:将细胞离心于离心管内,测定细胞层所占体积。细胞密实体积(PCV)法 细胞鲜重或干重 有丝分裂指数,二、植物细胞的大规模培养,1.植物细胞的悬浮培养 4)细胞活力测定 相差显微镜观察法 FDA染色法:在活细胞
15、中,FDA被裂解,荧光素被释放出来,在活细胞积累,而在死细胞中不能积累。伊凡蓝染色法:与FDA相反,死细胞能摄取染料。,二、植物细胞的大规模培养,2.植物细胞固定化培养 细胞固定化定义 指将游离的细胞包埋在多糖或多聚化合物制备成的网状支持物中,培养液呈流动状态,进行无菌培养的一种技术。细胞固定化具有以下意义1)细胞生长较慢,有利于次生代谢物的积累。2)易控制化学环境、收获次生代谢产物。3)细胞经包埋后受剪切力损伤小。4)有利于进行连续培养和生物转化。,二、植物细胞的大规模培养,2.植物细胞固定化培养植物细胞固定化技术包埋法:将细胞包埋在多也载体内部使细胞固定的技术。常用的固定剂包括:如海藻酸盐
16、、卡拉胶、琼脂、琼脂糖、交叉藻聚糖、明胶、聚丙酰胺等。吸附法:利用细胞能吸附到固体物质表面或其他细胞表面的能力进行培养。常用的载体多为多孔性惰性物质材料,如聚氨酯泡沫、尼龙网、生物膜等。,二、植物细胞的大规模培养,2.植物细胞固定化培养,三、植物细胞生物反应器,植物细胞生物反应器是指用于植物细胞批量化培养的装置及其相应控制系统。适合植物细胞培养的反应器应该具有适宜的氧传递、良好的流动性和较低的剪切力。根据大规模培养方法主要分为悬浮培养生物反应器和固定化培养生物反应器两种。,三、植物细胞生物反应器,1.植物细胞悬 浮培养生物反应器1)机械搅拌式生物反应器,三、植物细胞生物反应器,1.植物细胞悬
17、浮培养生物反应器2)气升式生物反应器,三、植物细胞生物反应器,1.植物细胞悬 浮培养生物反应器3)鼓泡式生物反应器,三、植物细胞生物反应器,1.植物细胞悬 浮培养生物反应器4)转鼓式生物反应器,三、植物细胞生物反应器,1.植物细胞悬 浮培养生物反应器,三、植物细胞生物反应器,2.植物细胞固定化生物反应器1)流化床生物反应器2)填充床生物反应器3)膜生物反应器,填充床与流化床反应器,四、植物细胞培养生产次生代谢产物,初级代谢产物(Primary metabolites)是通过初级代谢产生的维持细胞生命活动必需的物质,如氨基酸、核苷酸、多糖、脂类等。在不同种类的细胞中,初级代谢产物的种类基本相同。
18、初级代谢产物的合成无时无刻都在进行着,任何一种产物的合成发生障碍都会影响细胞正常的生命活动,甚至导致死亡。次级代谢产物(Secondary metabolites)是通过次级代谢合成的产物,是指植物中一大类并非植物生长发育所必需的小分子有机化合物,其产生和分布通常有种属、器官组织和生长发育期的特异性。大多是分子结构比较复杂的小分子化合物,例如抗生素、激素、生物碱、毒素等。由于次级代谢产物大多具有生物活性,因此是植物代谢产物研究的重点。次生产物在植物中的合成与分解过程称为次生代谢。,四、植物细胞培养生产次生代谢产物,植物次生产物的主要类型酚类化合物黄酮类、醌类和简单酚类黄酮类:结构:C6-C3-
19、C6生物合成前体:苯丙氨酸和丙二酸单酰辅酶A。功效:为治理心血管疾病和高血压的药物成分。醌类化合物:结构:由苯式多环芳烃衍生的芳香二氧化合物,种类:苯醌、萘醌。功效:呈现颜色,具有抗菌、抗癌作用。,四、植物细胞培养生产次生代谢产物,植物次生产物的主要类型萜类化合物 组成单元:异戊二烯 合成途径:异戊二烯途径 种类:单萜、倍半萜、二萜、三萜以及甾类化合物。萜类化合物已超过2万种。单萜和倍半萜是植物挥发油和香料的主要成分,有的具有重要的药用价值。倍半萜:抗疟疾药物青蒿素。二萜生物碱:抗癌药物紫杉醇。三萜皂甙:人参皂甙。甾体皂甙:薯蓣皂甙。,四、植物细胞培养生产次生代谢产物,植物次生产物的主要类型含
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