细胞工程植物细胞培养.ppt

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1、第四章 植物细胞培养,植物细胞培养（plant cell culture）是指在离体条件下对植物单个细胞或小的细胞团进行培养使其增殖的技术。根据培养规模：小规模培养和大批量培养；根据培养方式：悬浮培养、单细胞培养等；根据要求产物：用于诱变的细胞培养和生产次生产物的细胞培养。,第五章 植物细胞培养,4.1 单细胞分离,4.3 单细胞培养技术,4.2 悬浮培养,4.4 细胞培养与次生产物生产,由完整的植物器官分离单细胞由培养组织中分离单细胞,4.1 单细胞分离,叶片是分离单细胞的最好材料(1)机械法(2)酶解法,4.1.1 由完整的植物器官分离单细胞,撕去下表皮,露出叶肉细胞,用解剖刀刮下细胞,(

2、1)机械法,用刀片刮叶片,叶片研碎、离心,研碎匀浆,加研磨介质,过滤、离心,(1)机械法,只有薄壁组织排列松散，细胞间接触点很少时用机械法分离叶肉细胞才能取得成功。,Takebe等（1968）最早报道：用果胶酶处理可以分离大量的叶肉细胞,(2)酶解法,加果胶酶,过滤、离心,(1)诱导产生愈伤组织；,(2)愈伤组织反复继代，使组织不断增殖，提高愈伤组织的松散性；,4.1.2 由培养组织分离单细胞,步骤：,茎段,摇床用于振荡,继代,悬浮,15ml medium/1g,120rpm culture,transfer 1time/3d 3 weeks,100-130目网过滤,Centrifuge(离心

3、）isolation,(3)将愈伤组织在液体培养基中培养，建立悬浮培养物,选择适宜的外植体：幼胚、胚轴、子叶是最常使用的外植体。选择适宜的培养基：较高激素浓度，特别是生长素，必要的附加物质，例如水解酪蛋白、Pro、Gln。继代多次，以获得均匀一致疏松的愈伤组织。,注意,悬浮培养是将单个游离细胞或小细胞团悬浮在液体培养基中进行培养增殖的技术。,4.2 细胞悬浮培养,4.2.1 细胞悬浮培养的概念和意义,Bioreactor for continuous,cell suspensions,Shaker for suspension culture,Culture wheel,(1)细胞可以不断增殖

4、，形成高密度的细胞群体，适于大规模培养；(2)能够提供大量较为均匀的细胞，为研究细胞的生长、分化创造方法和条件。,4.2.1 细胞悬浮培养的概念和意义,Cell suspension,Plants,Artificial seeds,Secondary products,Isolation protoplasts,Mutation select,4.2.2 细胞悬浮培养的应用,(1)培养基 对于用愈伤组织制备的悬浮细胞培养的培养基以原愈伤组织继代时的培养基除去琼脂为好。为了提高细胞的分散度，对于生长素和细胞分裂素的比例需要进行一些调节。,4.2.3 细胞悬浮培养的方法,最低有效密度的概念 在悬浮

5、细胞培养中，使悬浮培养细胞能够增殖的最少接种量称为最低有效密度或者临界的起始密度。最低有效密度由于培养材料、原种培养条件，原种保存时间长短、培养基的成分不同而有差异，一般为104-105细胞/ml。,4.2.3 细胞悬浮培养的方法,(2)培养细胞的起始密度及细胞记数,细胞记数 要保证细胞培养的最低有效密度，在细胞游离后要对分离的单细胞进行记数，可用血球记数板。,(2)培养细胞的起始密度及细胞记数,活细胞测定 除测定细胞密度外，尚需要测定活细胞率以作为测定起始密度的参考。活细胞率（%）=（5个视野中的活细胞数/5个视野中的细胞总数）*100%,(2)培养细胞的起始密度及细胞记数,A、醋酸酯荧光素

6、（FDA）染色法 FDA本身无荧光，无极性，可自由通过原生质体膜进入细胞内部，进入后由于受到活细胞内脂酶分解，而产生有荧光的极性物质荧光素，不能自由出入原生质体膜，在荧光显微镜下观察到荧光的是有活力的，反之无活力。具体操作：取0.5ml细胞悬浮液放入到小试管中，加入FDA溶液，使最后浓度达到0.01%，混匀，室温下作用5min，荧光显微镜观察。,活细胞测定的方法,B、酚藏红花染色法 先配制0.1%酚藏红花溶液，溶剂为培养液。检查时将悬浮细胞取一滴放在载玻片上，滴一滴0.1%酚藏红花，盖上盖玻片，染成红色的是死细胞，无色的是活细胞。,（3）悬浮培养细胞数目的增殖变化,细胞生长各个时期的特点,滞后

7、期（延迟期）细胞很少分裂，其长短与接种 量大小和继代时原种细胞所处的生 长期有关。,对数生长期 细胞分裂活跃，细胞数目增加，增 长速率保持不变。,直线生长期 细胞增值、生长和发育最明显的时期。,缓 慢 期 生长逐渐缓慢,培养液消耗将尽，有 毒代谢物质增多，氧气减少。,静 止 期 生长几乎处于停止状态，细胞数目 增加极少，甚至开始死亡。,A、滞后期的长短主要取决于在继代时原种培养细胞所处的生长期和转入细胞数量的多少。B、加入条件培养基可以缩短滞后期。条件培养基：曾培养过一段时间组织或细胞的培养基。C、缩短两次继代时间间隔，则可使悬浮培养的细胞一直保持对数生长期。D、如果使处在静止期的细胞悬浮液保

8、持时间太长，则会引起细胞的大量死亡和解体。,讨论,对悬浮培养细胞继代时，进液口的孔径要小，只能通过单细胞或小细胞团（2-4细胞），使用吸管或注射器。继代前，培养容器静置短时间，大细胞团沉降，再吸上层悬浮液。依此，多次，可建立良好的细胞悬浮培养物。,操作注意事项,对于任何一个建立的细胞悬浮系都应该进行动态的测定，以掌握其生长的基本规律，为继代培养或其他研究提供依据。A、细胞记数：注意：由于悬浮培养的细胞并不会呈游离单细胞，因此 通过培养瓶中直接取样很难进行可靠的细胞记数。可用5%-8%铬酸或0.25%的果胶酶对细胞团进行处理。生长速率p P=（lnX-lnX0）/t X为t时间的细胞密度，X0为

9、起始细胞密度,（4）细胞生长的测定,B、细胞大小的测定：显微测微计技术；C、细胞体积：将一定量的细胞悬浮液放入放入15ml刻度离心管中于2000g离心5min。以每毫升培养液中细胞体积的毫升数来表示。D、细胞的干重和鲜重的测定：将一定量的细胞悬浮液加到预先称重的尼龙布上，用水冲洗并抽滤除去细胞粘着的多余水滴，然后称重，两者差就是细胞的鲜重。干重一般是将离心收集的细胞转移到预先称重的滤纸片上，然后在60烘12h，在干燥器中冷却后称重。细胞的干重和鲜重一般以每毫升悬浮培养物的重量表示。,E、有丝分裂指数 在一个细胞群体中，处于有丝分裂的细胞占总细胞的百分数称为有丝分裂指数，指数越高，分裂进行的速度

10、越快。一般用孚尔根染色法，先将组织用1molHCl在60水解后染色，常规镜检，统计500个细胞，计算。,悬浮培养物分散性良好，细胞团较小，一般在3050个细胞以下，在实际培养中很少有完全由单细胞组成的植物细胞悬浮系。均一性好，细胞形状和细胞团大小大致相同。悬浮系外观为大小均一的小颗粒，培养基清澈透亮，细胞色泽呈鲜艳的乳白或淡黄色。细胞生长迅速，悬浮细胞的生长量一般23天甚至更短时间便可增加一倍。,（5）一个成功的悬浮细胞培养体系 必须满足三个条件,起始愈伤组织的质量：松散性好、增殖快、再生能力强。其外观一般是色泽呈鲜艳的乳白或淡黄色，呈细小颗粒状，疏松易碎。接种细胞密度：接种初期的细胞密度过低

11、往往使延迟期加长，悬浮细胞的起始密度一般在0.52.5105个细胞/毫升，低于这一密度则会使细胞生长延迟。培养条件：方式、温度、继代周期。,（6）影响悬浮细胞生长的因素,细胞同步化是指同一悬浮培养体系的所有细胞都同时通过细胞周期的某一特定时期。同一培养体系中，细胞不同步使悬浮细胞的分裂、代谢以及生理、生化状态等更趋复杂化，所以人们一直希望通过一定的技术途径，使同一培养体系中的细胞能保持相对一致的细胞学和生理学状态，工作中常用的处理方法：,5.2.4 悬浮细胞的同步化,（1）物理方法 分选法 通过细胞体积大小分级，直接将处于相同周期的 细胞进行分选，然后将同一状态的细胞继代培养于同 一培养体系中

12、。,5.2.4 悬浮细胞的同步化,Fujimura分离胡萝卜悬浮液,悬浮液,47m膜过滤,滤液,31m膜过滤,收集,网上细胞,加入等体积的培养基,加入到10%-18%的Ficoll,180g离心5min,收集各细胞层的细胞,用培养基洗涤,分别接种,（2）抑制剂法 通过一些DNA 合成抑制剂处理细胞，使细胞停留在DNA合成前期，当解除抑制后，即可获得处于同一细胞周期的细胞。常用的抑制剂有5-氟脱氧尿苷，5-氨基尿嘧啶、羟基尿等。（3）有丝分裂阻抑 用秋水仙素处理指数生长的悬浮培养物，浓度一般控制在0.2%，处理时间以4-6小时为宜。,4.2.4 悬浮细胞的同步化,（4）饥饿法 悬浮培养细胞中，若

13、断绝供应一种细胞分裂所必需的营养成分或激素，使细胞停滞在G1或G2期，经过一段时间的饥饿之后，当在培养基中重新加入这种限制因子时，静止细胞就会同步进入分裂。（5）冷处理法。低温处理可以提高培养体系中细胞同步化的程度,4.2.4 悬浮细胞的同步化,无论何种细胞同步化处理，对细胞本身或多或少都有一定的伤害。如果处理的细胞没有足够的生活力，不仅不能获得理想的同步化效果，还可能造成细胞的大量死亡，因此在进行同步化处理之前，细胞必须进行充分的活化培养。用于处理的细胞系最好处于对数生长期。,4.2.4 悬浮细胞的同步化,4.3 单细胞培养技术,（1）建立单细胞无性系 悬浮培养细胞间细胞间在遗传、生理和生化

14、上存在差异，这些差异反映在它们的产量、品质、抗病虫性和抗逆性等方面。如果能将高抗、高产、高品质的细胞株筛选出来，无疑会带来巨大的经济效益。（2）排除体细胞的干扰（3）利于对细胞活动跟踪观察,4.3.1 植物单细胞培养的意义,(1)细胞平板培养 概念：将制备好的单细胞悬浮液，按照一定的细胞密度，接种在1mm左右的薄层固体培养基上进行培养，称之为平板培养。主要技术要点：单细胞的分离：一般采用酶分离法，小细胞团不能超过6个细胞，因此过滤时网筛的网眼要选择合适。单细胞悬浮液的制备：分离的单细胞经培养基洗涤2次以后，调整密度为5105/ml。,4.3.2 单细胞培养的方法,植板：将1份已调整好密度的单细

15、胞悬浮液与4份35的固体培养基充分混合均匀，然后均匀的平铺于培养皿中，其厚度为1-2mm。待植板后的培养基完全凝固后，用石蜡或parafilm封口膜将培养皿封严以防污染，在25黑暗条件下培养3周即可长出肉眼可见的愈伤组织。,植板率评估：它以能长出细胞团的单细胞在接种单细胞中所占的比例来表示。植板率()(形成的细胞团数/接种的细胞数)100 计算式中每个平板新形成的细胞团数的计数方法有两种：一是直接计数法，注意计量时要掌握合适的时间，即细胞团肉眼已能分辨，但尚未长合到一起的时候。二是感光法，在暗室的红光下将一印相纸放于欲计数的培养皿下，其上放一光源使培养皿中细胞团印到相纸上，冲洗照片计数。,（2

16、）看护培养 概念：用一块愈伤组织或植物离体组织看护单细胞使其生长增殖的一种单细胞培养方法。,4.3.2 单细胞培养的方法,（3）微室培养 概念：人工制造一个小室，将单细胞培养在小室中的少量培养基上，使其分裂增殖形成细胞团的方法，称微室培养。,4.3.2 单细胞培养的方法,特点：（1）能在显微镜下追踪单细胞分裂增殖形成细胞团的全过程；（2）培养基少，营养和水分难以保持，pH值变动幅度大，培养细胞仅能短期分裂。,（4）其它单细胞培养技术 A 饲养层培养基技术 将饲养细胞先用射线辐射处理，然后将饲养细胞和培养细胞混合植板，经过照射的细胞对于培养细胞起到一个饲养作用。B 双层滤纸植板培养方法,培养基,

17、饲养层细胞,看护滤纸层,转移碟滤纸,培养细胞,4.3.2 单细胞培养的方法,4.4.1 概述 4.4.2 培养系统 4.4.3 植物细胞规模培养技术要点技术要点 4.4.4 提高细胞次生代谢产物的途径 4.4.5 细胞规模化培养中的有关技术问题,4.4 植物细胞大规模培养 与次生代谢产物生产,4.4.1 概述,植物次生代谢产物是指植物中一大类并非植物生长发育所必需的小分子有机化合物，其产生和分布通常有种属、器官组织和生长发育期的特异性。次生产物在植物中的合成与分解过程称为次生代谢。,（1）植物产生代谢产物的类型 植物次生产物种类繁多（据保守估计已超过2万种），根据分子结构不同大致分为：酚类化合

18、物黄酮类 单酚类 醌 类（苯醌、萘醌、蒽醌）,萜类化合物三萜皂甙 甾体皂甙 单萜、倍半萜、二萜含氮化合物生物碱（真生物碱、伪生物碱、原生物碱）胺类（伯、仲、叔、季胺）非蛋白质氨基酸 生氰甙多炔类、有机酸等,（2）植物次生代谢产物在医药、食品、轻化工业等领域具有重要意义。李时珍（1593）在本草纲目中所开列的1892种药物绝大多数是植物药物，目前仍有约25的法定药品来自植物。其药物的有效成分均为次生产物。许多植物次生代谢产物是优良的食品添加剂和名贵化妆品原料。有些是生物毒素的主要来源，可以用于杀虫、杀菌，而对环境和人畜无害，是理想的环保产品。,4.4.1 概述,（3）规模化细胞培养是生产植物次生

19、产物的理想途径 保护生态环境 提高生产效率 发展新型生物技术产业,4.4.1 概述,植物细胞大规模培养的技术要求：从工程的角度讲必须要进一步研究和开发适宜于植物细胞生长和生产的生物反应器，建立最佳的控制和调节系统；从培养技术方面讲必须满足以下三个条件：培养的细胞在遗传上应是稳定的，以得到产量恒定的产物；细胞生长及生物合成的速度快，在较短的时间内能得到较高产量的终产物；代谢产物要在细胞中积累而不被迅速分解，最好能将其释放到培养基中。,4.4.1 概述,4.4.2 培养系统,A 悬浮培养系统 液体悬浮培养系统基本原理与上述实验室悬浮培养方法一致，但大规模培养所采用的设备及控制技术比实验室小规模培养

20、要复杂的多。,机械搅拌式培养系统 机械搅拌式生物反应器通常是在微生物发酵罐的基础上改进设计的，根据植物细胞的特性，其设备要求在微生物发酵罐的基础上作如下改进：搅拌装置要减少剪切，一般改叶轮式为螺旋式；因为植物细胞生长周期长，需要随时补充水分和营养，因此必须设计加液装置；由于植物细胞的生理活动需要新鲜空气，且细胞代谢也可能产生有害气体，所以必须设计通气装置；为便于取样观察，一般还设计有取样口。,A 悬浮培养系统,机械搅拌式培养系统,A 悬浮培养系统,气压搅拌式培养系统 考虑到机械搅拌式反应器的剪切作用难以避免，同时搅拌器转动的中轴往往是容易使培养物污染的部位，因此，发展出空气提升式生物反应器，但

21、其缺点是搅拌不均匀。旋转式培养系统 一般用于产品中试或某些必需裂解细胞才能获得目的产物的培养，其优点是控制精确，处理灵活，缺点是培养体积较小。,旋转式培养系统,这一技术的优点在于：可以较容易地控制培养系统的理化环境，从而可以研究特定的代谢途径，并便于调节；细胞位置的固定使其所处的环境类似于在植物体中所处的状态，相互间接触密切，可以形成一定的理化梯度，有利于次生产物的合成；由于细胞固定在支持物上，培养基可以不断更换，可以从培养基中提取产物，免除了培养基中因含有过多的初生产物对细胞代谢的反馈抑制，也由于细胞留在反应器中，新的培养基可以再次利用这些细胞生产初生产物，从而节省了生产细胞所付出的时间和费

22、用；,B 固定化培养系统,正是由于细胞固定在一定的介质中，并可以从培养基中不断提取产物，因此，它可以进行连续生产。细胞固定化培养技术按照其支持物不同可以分为两大类：包埋式固定化培养系统：支持物多采用琼脂、琼脂糖、藻酸盐、聚丙烯酰胺等；附着式固定化培养系统：支持物采用尼龙网、聚氨酯泡沫、中空纤维等材料。,4.4.3 植物细胞规模培养技术要点,（1）细胞系的建立和选择,有效成分分析,悬浮细胞系,单细胞培养与筛选,细胞增殖,（2）优良细胞系的增殖培养 所选择的优良细胞系，进行大规模繁殖，得到足够的细胞是建立细胞规模化培养体系的中间环节。,（3）大规模培养体系的建立 一步法逐级放大：对于细胞生长与目的

23、产物合成同步的类型，一般采用此方法建立大规模培养系统。两步法：用于目的产物合成在细胞生长发育到一定时期进行，细胞生长和产物合成需要不同的培养基的类型。先在细胞生长培养基中培养大批量细胞，当细胞生长至合成产物的阶段后，再将其转入到产物合成培养基中培养。如果采用固相培养方式生产次生产物，一般均需采用两步法建立体系。,培养方式的选择：间歇培养流加间歇培养 两级或多级间歇培养 连续培养单级连续培养 多级连续培养 回流式连续培养 固定化细胞培养,4.4.4 提高细胞次生代谢产物的途径,（1）明确植物细胞生长与产物合成的关系 生长偶联型 产物合成与细胞生长成正比。如长春花属植物中的长春花碱的合成、烟草细胞

24、的烟碱合成、薯蓣属植物中的薯蓣皂甙的合成等；中间型 产物仅在细胞生长下降时合成，细胞处于指数生长期或停止生长产物都不合成。蒽醌类物质合成的植物细胞，托品类生物碱类合成的植物细胞等属于此类型；非生长偶联型 产物合成在细胞生长停止以后。如紫草宁的合成。,（2）选择适宜的起始材料 首先必须选择能够高效合成目的产物的植物种类。再此前提下，起始培养材料还应考虑器官和组织特异性，通常选取自然状态下能够积累次生产物的部位，这样的细胞经过培养后常具有合成目的产物的能力，或比较容易诱导合成目的产物。同时要筛选高产、稳产的细胞株系。,（3）选择合适的培养基成分 一般来说，增加培养基的N，P、K的浓度能促进细胞生长

25、，而适当增加糖浓度有利于次生产物的合成。培养基的成分包括培养条件要通过一定的实验才能选择出既有利于细胞大量生长繁殖又有利于次生代谢产物大量产生的培养基。,（4）外因 温度 pH 营养状况 通气状况,（5）激发子的应用 植物细胞次生代谢除了自身的遗传或发育基础外，通常还与诱导因子有关。在一些不良环境或有微生物侵入的情况下，细胞次生代谢活动显著增强。因此，人为合理的应用这些诱导因子，就有可能提高目的产物的产量。激发子也称诱导子，是指能够诱导植物细胞中一个反应，并形成细胞特征性自身防御反应的分子。A、非生物激发子，如辐射、金属离子等B、生物激发子，（外源激发子，多来源于微生物，内源激发子，来源于植物

26、本身的物质，如降解细胞壁的酶类，细胞碎片、寡聚糖等。,（6）培养技术的选择 包括对反应器的选择和对培养方式的选择，就目前的技术基础来讲，固定化培养是植物细胞规模化生产较为理想的系统。为了同时满足细胞生长和产物合成的需要，通常需要在不同阶段使用不同的培养基，即两阶段培养 为了解决产物对合成的反馈抑制可以采用两相培养技术，液-液系统：分离相常用的有液体石蜡、烷类化合物、甘油等液-固系统：常用的有活性炭、硅酸镁载体、沸石、蚕丝、树脂等。一般来说，提取相的选择目标是具有较大的分离能力，同时对于没有毒副作用，不影响产物的化学稳定性。,4.4.5 细胞规模化培养中的有关技术问题,（1）悬浮培养系统必须适应

27、植物细胞特性（2）植物细胞培养液的流变特性 植物细胞培养液的流变特性常用粘度来描述 培养过程中培养液的粘度变化可由细胞密度和细胞分泌物以及细胞状态引起。如烟草培养液的表观粘度培养过程中主要是由培养细胞密度的增加引起的，当细胞密度低于7gL-1时，培养液的粘度基本保持不变，而当细胞密度高于此值时，培养液的粘度即增加。长春花细胞培养，当细胞密度在10 gL-1时，培养液属于假塑性流体，此时，培养液的粘度依赖于细胞年龄、形态和细胞团的大小。在相同物质浓度下，大细胞团的营养液表观粘度明显大于小细胞团培养液的表观粘度。,O2：KLa（体积氧传递系数，单位时间、单位体积氧量）：如在4L的气升式反应器中进行

28、长春花细胞培养时，KLa在20h-1左右时，细胞生长与次生产物合成均维持在良好状态；又如在15L的通风式反应器中培养的烟草细胞，当 KLa值在510h-1的范围内，随着 KLa的增加，生物量和代谢产物也呈线性增加。溶氧浓度：曾在不同氧浓度下对毛地黄细胞培养进行培养，结果显示，当培养基氧浓度从10%饱和度上升至30%时，细胞的生长速率从0.15d-1上升至0.20-1，如果溶氧浓度继续上升至40%饱和度时，细胞生长速率反而下降至0.17d-1。,（3）植物细胞培养过程中的气体调节,CO2：植物细胞能非光合地利用CO2，如在通气调节过程中，混入2%4%的CO2即能消除高通气速率对长春花细胞生长和产

29、生代谢产物的不利影响。总之，对于植物细胞规模化培养来讲，在要求培养基充分均匀的同时，O2和CO2的浓度必需达到某一平衡状态。,植物细胞大规模培养中易产生大量的泡沫，且覆盖有蛋白质和粘多糖，因而粘性大，细胞极易被包埋在其中从循环的培养液中带出来，形成非均相培养而影响培养系统的稳定性和生产率。控制泡沫的方式目前通常采用化学和机械两种方法。,（4）泡沫和表面粘附性,化学消泡剂必需满足以下条件：(1)具有较低的表面张力和一定的亲水性，以使消泡剂对气/液界面的分散系数足够大，消泡作用迅速有(2)化学性质稳定，在水中的溶解度小，不与次生产物起任何化学反应，对植物细胞无毒害；(3)不影响气体在营养液中的传递

30、和溶解；(4)来源方便，价格便宜。常用的化学消泡剂包括天然油脂类、高级醇类、聚醚类和硅酮类。实际应用中必需根据所培养的植物种类、次生产物特性具体选择。,机械消泡是靠机械装置实现的。其优点是勿需在培养液中加入其它物质，从而减少了由于消泡剂所引起的污染和对后续分离工艺的影响。但机械消泡效果常不如化学消泡迅速彻底，同时机械消泡也会增加培养装置的复杂性。植物细胞规模化培养中的另一个问题是，细胞往往会粘附于培养液表面以上的器壁上，或电极的挡板上使这些细胞脱离于培养液造成细胞死亡，培养液表面以上的细胞可采用机械去除，电极上的细胞多采用在电极上涂布硅油以防止细胞粘附。,在大规模的培养中，植物细胞 对剪切力的敏感性一直是力求解决的主要技术问题之一。剪切力对植物细胞的伤害主要表现在机械损伤，表现为细胞团变小，细胞破损等，从而造成细胞内含物释放到培养基中，从而改变了培养系统的物理特性如 PH，流变特性等，进而影响整个培养系统的细胞生长和产物积累。因此目前植物细胞反应器的设计原则为提高混合程度和降低剪切力。,（5）剪切力对植物细胞的影响,