实时荧光定量PCR技术.ppt

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1、2023/11/22,1,临床分子生物学检验,第三章 核酸扩增技术（2）,2023/11/22,2,主要内容,第一节 聚合酶链反应 第二节 其他PCR相关技术第三节 实时/荧光定量PCR技术第四节 PCR产物分析,2023/11/22,3,标准的PCR反应体系总体积 XA 0.11ugB 各0.10.2umol/LC 2.5u D 各200umol/LE 含 缓冲液 1.5 mmol/L,PCR扩增反应体系配制,2023/11/22,4,PCR的程序编排与解读,时间（min）,温度,（）,重复 X 步Y 轮,目的DNA片段扩增 Z 倍以上,A,2023/11/22,5,第三节 实时/荧光定量P

2、CR,在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法,Real-time/Fluorescence Quantitive Polymerase Chain Reaction,2023/11/22,6,常规PCR技术：对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析。无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测（开盖检测“气溶胶”污染问题）。,实时/荧光定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析,实时/荧光定量PCR的优势,2023/11

3、/22,7,由于各反应管内PCR扩增效率的差异使得相同的样品扩增结果存在很大差异,同时扩增96份相同样品的Ct值一样，最终产物量却差异巨大,终点检测法定量的缺点,2023/11/22,8,荧光定量PCR实时检测的优点,终产物量一样起始量不同,2023/11/22,9,普通和实时定量PCR的综合比较表,2023/11/22,10,荧光染料法 SYBR green:特异性结合双链，释放荧光信号荧光探针法 1.Taqman技术 2.molecular Beacon技术 3.复合探针法,一、荧光定量PCR荧光标记物,2023/11/22,11,（一）荧光染料法,SYBR荧光染料SYBR荧光染料能特异性

4、地掺入DNA双链，发出荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发出任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。此方法未使用目的特异性探针，其特异性完全由引物决定。在有非特异双链DNA产生时，其荧光也同样增强，此法与常规PCR的特异性差别不大。,2023/11/22,12,SYBR Green 能结合到双链DNA的小沟部位,SYBR Green 只有和双链DNA结合后才发荧光 变性时，DNA双链分开，无荧光 复性和延伸时，形成双链DNA，SYBR Green 发荧光，在此阶段采集荧光信号。,SYBR Green,2023/11/22,13,原理：未结合DNA的SYBR染料

5、不发荧光，但只要掺入DNA双链，SYBR荧光染料能发射荧光，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加同步。,SYBR荧光染料法,2023/11/22,14,SYBR Green 法优缺点,2023/11/22,15,（二）荧光探针法,5端标记有报告基团(Reporter,R)，如FAM、VIC等 3端标记有荧光淬灭基团(Quencher,Q)探针完整，R所发射的荧光能量被Q基团吸收，“不发”荧光，R与Q分开，发荧光 Taq酶有 53外切核酸酶活性，延伸时水解探针,1水解探针技术（Taqman技术）,2023/11/22,16,TaqMan技术原理示意图,2023/11/22,17,2023/1

6、1/22,18,Taqman探针+UNG酶技术动画,2023/11/22,19,TaqMan法优缺点,2023/11/22,20,Taqman技术的延伸：TaqMan-MGB探针,针对Taqman探针荧光淬灭不彻底的问题，MGB探针，3端采用了非荧光性的淬灭基因淬灭基团吸收报告基团的能量后并不发光，大大降低了本底信号的干扰。,2023/11/22,21,TaqMan-MGB探针示意图,此外，MGB探针的3端还连接了一个三肽，可以大大稳定探针与模板的杂交,升高探针Tm 值,使较短的探针同样能达到较高的Tm 值而短探针的荧光报告基团和淬灭基团的距离更近,淬灭效果更好，荧光背景更低，信噪比更高。,2

7、023/11/22,22,将荧光供体分子和受体分子分别标记在两个不同的探针上，产生荧光供体探针和受体探针。与靶序列退火时，两探针的荧光供体和受体分子紧密相邻，发生FRET产生荧光。荧光强度与起始模板的量成正比，以此可进行PCR定量分析。,2.杂交探针技术,2023/11/22,23,3Molecular beacon技术(分子信标法),工作原理发夹形的寡聚核苷酸探针 内部淬灭荧光团,2023/11/22,24,4复合探针法（complex probes）该法的基本原理是首先合成两个探针，一是荧光探针（25bp），5端接一荧光分子，另一为淬灭探针（15bp），3端接一淬灭分子，淬灭探针能与荧光探

8、针5端杂交。,2023/11/22,25,几种荧光定量PCR标记法的应用比较,2023/11/22,26,我校配备的实时荧光PCR仪,ABI-Step one,罗氏 Light Cycler,二、荧光定量PCR设备原理,2023/11/22,27,ABI 7500荧光定量PCR仪,MJ公司Chromo 4荧光定量PCR仪,Bio-rad公司iCycler荧光定量PCR仪,普通实时荧光PCR仪,2023/11/22,28,普通实时荧光PCR仪信号采集示意,2023/11/22,29,离心式实时荧光PCR仪,Rotor-Gene 3000荧光定量PCR仪,Roche Light CycleTM荧光

9、定量PCR仪,2023/11/22,30,离心式荧光定量PCR仪结构示意,2023/11/22,31,温度均一性较好；使用同一个激发光源和检测器，随时检测旋转到跟前的样品，有效减少系统误差；可容纳样品量少，需用特殊毛细管，增加使用成本，不带梯度功能。,Roche离心式实时定量PCR仪特点,2023/11/22,32,三、实时荧光PCR结果分析,32,2023/11/22,33,实时荧光PCR结果分析示例,2023/11/22,34,定量原理,介绍三个概念：扩增曲线、荧光阈值、Ct值,如何对起始模板定量？,通过Ct值和标准曲线对起始模板进行定量分析,2023/11/22,35,实时荧光PCR结果

10、分析扩增曲线,Cycle（循环数）,Rn（荧光强度）,Baseline,Lgliner phase,平台期,扩增曲线图：横坐标：扩增循环数（Cycle）；纵坐标：荧光强度 每个循环进行一次荧光信号的收集,2023/11/22,36,2023/11/22,37,荧光信号阈值（threshold）：前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline），即样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值 荧光域值的缺省设置是315个循环的荧光信号的标准偏差的10倍真正的信号:荧光信号超过域值,荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，一般荧光域值的设置是基线（背景）荧

11、光信号的标准偏差的10倍。,实时荧光PCR结果分析荧光阈值,2023/11/22,38,Ct值的定义：PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。,实时荧光PCR结果分析 Ct值,2023/11/22,39,实时荧光PCR结果分析 Ct值的重现性,39,Ct值的特点：相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定；Ct值极具重现性。,2023/11/22,40,在反应体系中加入荧光分子，通过荧光信号的按比例增加来反应DNA量的增加，监测到的荧光信号的变化可以绘制成一条曲线。设定一个荧光阈值，得到样品的Ct值。,实时荧光PCR结果分析小结,2023/11/22,41,临

12、床检验中实时定量PCR两种目标,2023/11/22,42,实时荧光定量PCR 原理-标准曲线,模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少，即Ct值越小 Log浓度与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线,2023/11/22,43,确定未知样品的 C(t)值 通过标准曲线由未知样品的C(t)值推算出其初始量,实时荧光定量PCR原理-绝对定量,2023/11/22,44,阴性对照,标准品,待测样品,绝对定量实验设置,2023/11/22,45,标准品(standard):例如质粒，做系列梯度稀释,绘制标准曲线,标准曲线：Y=a*log(X)+b,2023/11/22,46,

13、用于测定样品间某个基因表达水平变化的差异倍数,相对定量,两组样品：对照组和实验组 两个基因：内参基因和目的基因 不使用标准曲线，用 Ct法计算,2023/11/22,47,对照组,实验组,目的基因,内参基因,相对定量实验设置,2023/11/22,48,对照组,实验组,目的基因 Ct,内参基因Ct,34,32,18,19,相对变化倍数=2-Ct,Ct(实验组)=Ct(目的基因)-Ct(内参基因)Ct(对照组)=Ct(目的基因)-Ct(内参基因),Ct=Ct(实验组)-Ct(对照组),Ct法计算相对变化倍数,2023/11/22,49,荧光定量PCR技术的主要医学应用,定性分析研究：杂合或纯合子

14、鉴定，（SNPs）分析等绝对定量研究：病毒和病原菌定量分析，基因拷贝数定量，GMO定量检测等相对定量研究：mRNA表达量分析，siRNA效果确认，差异显示结果验证等,2023/11/22,50,第四节,PCR产物分析,2023/11/22,51,PCR扩增产物的检测与分析,凝胶电泳1琼脂糖凝胶电泳法 琼脂糖凝胶电泳法的操作方法简单，能对PCR产物的长度进行粗略的鉴定，是应用最广泛的检测PCR产物的方法。不同浓度的凝胶分辨DNA的有效范围不同，如表所示：,（一）PCR有效性和正确性（二）PCR产物的定量和序列分析,2023/11/22,52,琼脂糖浓度与分离线状DNA的有效范围,2023/11/

15、22,53,电泳分析,2023/11/22,54,PCR产物的检测,电泳分析,2023/11/22,55,2.聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）,特点：分辨力高，长度仅相差1bp的DNA分子即可分开；上样量远大于琼脂糖凝胶；回收的DNA纯度高(引物纯化)；采用银染色DNA或RNA，灵敏度高，比琼脂糖凝胶电泳中EB染色法高2-5倍，而且避免EB易退色弱点。用途：PCR扩增指纹图、多重PCR、PCR产物限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）分析。注意：相关试剂具有神经毒性。,凝胶电泳,2023/11/22,56,丙烯酰胺浓度与分离DNA分子的有效范围,2023/11/22,57,一、PCR-限制性片

16、段长度多态性分析法（polymerase chain reaction based on restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP）不同的限制性核酸内切酶有具识别的特异DNA序列，所以用特定的限制性核酸内切酶对目的DNA分子进行消化，得到的酶切片段其大小和数量可以在一定程度上反应出目的DNA分子的序列信息,用途：传染病病原体基因分型、人类基因的变异研究，是诊断遗传病和传染病病原体基因分型的常用方法,PCR产物中点突变的分析,2023/11/22,58,PCR-RFLP法,限制性内切酶,恶性肿瘤癌基因或抑癌基因的突变检测,Ras基因,突变

17、,限制性内切酶,2023/11/22,59,二、等位基因特异性寡核苷酸分子杂交（ASO）分别合成野生型和突变型探针，在等位基因DNA PCR扩增产物电泳分离后转移固定在膜上，分别与寡核苷酸探针杂交，可明确诊断是否有突变及突变是纯合子还是杂合子。其中，PCR产物不电泳分离，直接点膜杂交的叫斑点杂交。,PCR产物中点突变的分析,2023/11/22,60,等位基因特异性寡核苷酸探针杂交原理（Allele Specific Oligonucleotide,ASO）,2023/11/22,61,三、单链构型多态性分析法（PCR-Single Strand Conformation Polymorphi

18、sm，简称PCR-SSCP）将PCR 产物双链DNA（dsDNA）变性为单链DNA（ssDNA），加样于变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，由于DNA分子在凝胶中的电泳迁移率与其分子量和空间结构有关，而空间结构又与ssDNA序列有关。因此，电泳结束后，ssDNA带位置的差异即可反映出PCR产物序列的差异。,PCR产物中点突变的分析,2023/11/22,62,PCR-SSCP过程示意,-primer-32P-dNTP掺入 PCR扩增 产物 变性 单链DNA 中性聚丙烯酰胺凝胶电泳 1 2 3 4 5 自显影 1.为正常 结果分析 2、4、5纯合患者 3.为杂合子.,解链,构像,DAN,原 理,过 程,

19、2023/11/22,63,DGGE原理：当温度达到熔点温度(Tm)时，DNA 双链的部分区段解链。梯度增加凝胶内变性剂的浓度会促使双链DNA 解链，在凝胶中形成迁移率下降的分支分子。,四、变性梯度凝胶电泳DGGE,PCR产物中点突变的分析,通常在均一的运行温度（50-65C）和尿素与甲酰胺线性变性梯度条件下即形成变性环境，梯度以垂直或平行于电泳方向形成。DGGE 是灵敏的突变检测方法，其效率可达99%。,2023/11/22,64,垂直变性梯度凝胶电泳DGGE,（一）凝胶的变性梯度方向与电泳方向垂直：,从乳腺癌扩增p53 基因6 号外显子的野生型和突变型等位基因，通过垂直DGGE分离。,20

20、23/11/22,65,平行变性梯度凝胶电泳DGGE,p53 基因8 号外显子的野生型和突变型等位基因在平行梯度（4065%变性剂）DGGE凝胶上。左道，突变型等位基因；中，野生型等位基因；右，突变型与野生型等位基因。,（二）凝胶的变性梯度方向与电泳方向平行：,2023/11/22,66,五、熔点曲线 SYBR Green I 染料法,将温度与荧光强度的变化求导(-dI/dT),原始图谱,对数图谱,PCR产物中点突变的分析,2023/11/22,67,熔点曲线 SYBR Green I 染料法,熔点曲线分析，单一峰无非特异性荧光：单一特异产物,熔点曲线分析，出现杂峰其他产物出现非特异性荧光：多

21、个不同产物,2023/11/22,68,“双脱氧ddNTP”,六、PCR产物测序分析（直接或克隆后测序）,正常,PCR产物中点突变的分析,2023/11/22,69,小结：PCR产物的检测与分析,（一）PCR有效性和正确性 琼脂糖凝胶电泳法（二）PCR产物的定量和序列分析 琼脂糖凝胶电泳法、聚丙烯酰胺凝胶电泳PCR产物中点突变的分析：PCR-RFLP,ASO,SSCP,DGGE,熔点曲线分析，测序分析,2023/11/22,70,第五节,临床基因扩增检验的质量管理,2023/11/22,71,PCR的特点及应用,2023/11/22,72,一、临床PCR实验诊断的基本要求,1应该建立实验制度，

22、其中包括标本采集、接收、存放及处理制度、临床基因诊断实验室作制度、消毒及防止污染制度。2每个基因检测项目均建立操作及质量控制手册。3建立各级人员的工作职责；设立专业技术主管。4PCR实验室必备的条件不得缺少，否则不能开展临床基因实验诊断工作。5临床基因诊断实验室禁止无关人员出人，实验室主要通道出入口及各功能区域门口，应有“禁止入内”和“生物污染”等字样及标志。,2023/11/22,73,二.PCR操作程序标准化（一）上岗人员培训制度（二）标准化PCR诊断实验室（三）PCR标准化操作程序 1试剂配制、分装及保存 2标本的采集与处理 3基因扩增及其实验条件的选择 4扩增产物检测 5PCR结果的判

23、读（四）污染的预防及污染源的标准化处理,2023/11/22,74,PCR实验中污染的预防,严格执行各项规章制度，按规程进行实验操作；实验时，必须戴一次性手套（处理标本时需戴乳胶手套），并随时更换；工作衣、手套及实验用器材应分区固定使用；不在PCR实验室从事分子克隆实验，不得在室内从事与实验无关的事宜；保持地面及桌面整洁，保持室内温度恒定，室内禁止使用电风扇。,2023/11/22,75,所有用于标本采集的容器及基因扩增管等模板或扩增产物污染的物品，应置于1molL盐酸中临时存放，以减少室内气溶胶形成；标本扩增后产物及一次性使用物品等实验材料，实验完毕密封包装（包装袋应有明显的生物污染标记），

24、进行高压消毒并焚烧；对于不能进行高压消毒等方法处理的重复使用物品或器具，如塑料试管架等，可以用一般或专门消毒液浸泡消毒，如210的84消毒液；超净工作台使用前，紫外线灯消毒不少于20分钟，使用后先消毒液洗擦，再75乙醇擦一次。,PCR实验中污染源的标准化处理,2023/11/22,76,临床PCR实验诊断的其他注意事项-以实时荧光定量PCR检测为例,2023/11/22,77,特异性一定要高，避免引物的错配和二聚体（同样发光）；引物设计的时候要尽可能设计在同一退火温度；扩增子要跨内含子，避免微量基因组干扰；扩增子长度在80-250 bp左右。,注意事项一：引物设计特殊要求,-因为qPCR检测太

25、敏感,2023/11/22,78,RNA质量包含两个方面：样品的纯度和RNA的完整性,260/280在1.8至2.1,28s和 18s 条带明显，28s/18s 1.1,不要混入DNA污染，在加氯仿前离心，不取中间层,注意事项二：RNA的提取,2023/11/22,79,注意事项三：合理设置实验分组,标准品：梯度稀释用于绘制标准曲线 阳性对照：监测系统故障 阴性对照：监测样品污染 实验组：待测样品内参基因：校准生物学误差重复样品：降低操作误差,2023/11/22,80,内参基因的选择,内参基因：应该在实验干预条件下，在所有的待测样品中，内参基因的表达量都是不变的。,2023/11/22,81

26、,应寻找适合各自实验系统的特异性稳定表达的内参基因；选择一个以上的内参基因用作内参可得到更可靠的结果。,没有万能的内参基因,GAPDH在不同癌组织中的表达升高，在各种刺激下(例如低氧、胰岛素、地塞米松、表皮生长因子等),培养细胞GAPDH mRNA的表达水平也不同-actin 当细胞向恶性转化时表达水平增加。rRNA 在有丝分裂期间,28S、18S rRNA 明显减少。,2023/11/22,82,生物学重复和技术重复低丰度表达的基因要更多的重复,实验重复的设置,2023/11/22,83,使用微量移液器一定要仔细，勿产生 气泡，减少加样误差管理混乱和不戴手套，会造成试剂污染遮挡强烈日光和灯光

27、，保证试剂的稳定性,注意事项四：减少操作误差,2023/11/22,84,教学要求,1.掌握：PCR基本原理和反应过程、反应组分和相应条件;掌握反转录RT-PCR、实时定量PCR的技术原理.2.熟悉：以PCR为基础的相关核酸扩增技术如巢式PCR、多重PCR；熟悉PCR产物检测点突变的相关技术.3.了解：其他核酸扩增技术；了解临床基因扩增检验质量管理的概念和基本内容.,2023/11/22,85,周五实验课开课安排,实验内容：大肠杆菌质粒提取和琼脂糖电泳鉴定时间：2点-5点20分（连续5个学时）地点：实验楼二层西南角-分析实验室1分组：6个实验组，确定小组负责人要求1：复习理论，预习操作（实验动画8min）要求2：带实验指导，着白大衣，注意纪律。,