2022利用胸腔积液数字PCR检测改善结核性胸膜炎的诊断（全文）.docx

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1、2022利用胸腔积液数字PCR检测改善结核性胸膜炎的诊断(全文)研究背景结核病是严重威胁人类健康的传染病。2020年，全球估计有987万例新发结核病患者，约有151万例因此而死亡。结核性胸膜炎是一种常见的结核病类型，可引起胸膜增厚、结核性脓胸、乳糜胸和气胸等并发症，从而导致肺功能损害、慢性胸痛或呼吸困难，给患者带来极大危害。快速诊断和及时治疗可降低严重并发症的发生风险。然而，结核性胸膜炎的诊断具有一定的挑战性。由于胸腔积液中结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis,MTB)含量一般很少，病原学检测阳性率通常较低，例如，胸腔积液涂片染色镜检的敏感度通常10%,分枝杆菌培养

2、的敏感度通常30%,GeneXpertMTBRIF(Xpert)和XpertUltra的检测敏感度也分别介于21.4%22.7%和37.5%48.2%,而免疫学方法和生化参数诊断结核性胸膜炎的准确度也较差。因此，迫切需要新的方法来改善结核性胸膜炎的诊断水平。数字聚合式SJS(digitalpolymerasechainreaction,dPCR)是一种绝对定量微量核酸的有效方法。相比实时定量PCR,dPCR具有准确度高、重复性好、对抑制剂耐受性高、定量不需要标准曲线等优点。故本研究旨在评估胸腔积液dPCR检测对结核性胸膜炎的诊断性能。研究方法1 .研究对象。连续性纳入于首都医科大学附属北京胸科

3、医院就诊的年龄16岁的胸腔积液患者。所有纳入患者均进行一些检测以帮助明确诊断，具体为：MRI、CT.超声检查；与结核病相关的胸腔积液检测（包括涂片抗酸染色镜检、分枝杆菌培养、XPert和MTB抗体检测）和血液检测包括IFN-Y释放试验（IGRA）和MTB抗体检测;胸腔积液生化、病理或胸膜病理学检测等。本研究通过首都医科大学附属北京胸科医院医学伦理委员会批准。2 .病例分组。（1）确诊结核性胸膜炎组：影像学符合结核性胸膜炎且胸腔积液病原学检测结果为阳性（MTB涂片镜检、培养或核酸检测），或影像学符合结核性胸膜炎且胸腔积液或胸膜病理学检查阳性。（2）临床诊断结核性胸膜炎组：胸腔积液病原学检测结果阴

4、性，但影像学符合结核性胸膜炎；胸腔积液为渗出性，其腺昔脱氨酶（ADA）升高，同时免疫学检测阳性结核菌素皮肤试验（TSTlIGRA或MTB抗体。（3）非结核性胸腔积液组：明确诊断为其他疾病。所有检查均未提示合并结核病。3 .胸腔积液收集和DNA提取。收集每例患者3050ml胸腔积液进行常规临床检测，剩余胸腔积液室温下2000g离心10min,上清液分装冻存于-80oCo使用DNeasyBloodandTissueKits（69506zQiagen,HildenzGermany）试剂盒批量提取700l胸腔积液DNA,洗脱体积为50loDNA样品冻存于-80C,直至行dPCR检测。4 .dPCR检测

5、。本研究检测靶标为MTB特异性插入序列IS6110和ISIO81。20l反应体系包含10lddPCRTMsupermixforprobes,0.9M每条引物，0.2M每条探针，0.3U尿呦定-N-糖基化酶和5.3lDNA模板。将反应体系和70l微滴生成油添加到卡槽中，盖上胶垫,置于微滴生成仪生成微滴。将全部微滴转移至96孑饭后，18010s热封。PCR反应条件：3710min,9510min;9430s,5440s,循环40次；9810min,温度升降速率为2.0oCso扩增完成后，将平板加载到微滴读取仪，获取每个微滴的荧光信号。使用QuantaSoftVersion1.7.4.0917软件进

6、行数据分析。每次实验均采用无模板阴性对照和MTB基因组阳性对照。每份样品分别进行两次独立检测，每次均设复孔，最后结果取平均值。5 .统计学处理。使用SPSS13.0软件进行统计学分析。计数资料采用卡方检验或McNemar检验，连续性计量资料采用Studenfst检验、Mann-WhitneyU检验或Wilcoxon检验。采用受试者工作特征曲线(receiveroperatingcharacteristiccurve,ROC)进行诊断价值分析。采用多元logistic回归模型进行风险因素分析。采用Spearman相关性检验分析方法的一致性。以双侧P0.05为差异有统计学意义。研究结果1.病例纳入

7、。共纳入310例胸腔积液患者，其中，男性215例(69.4%),年龄范围为1693岁，中位数年龄为55岁；结核性胸膜炎患者183例(包括确诊92例和临床诊断91例)，其中，88%(161/183)的结核性胸膜炎患者伴有肺部或其他器官结核病灶;非结核性胸腔积液患者127例，包括：恶性胸膜间皮瘤12例、肺癌合并胸膜转移92例(鳞癌4例，腺癌77例，小细胞癌11例X其他癌症合并胸膜转移23例(乳腺癌5例,卵巢癌1例，胸腺瘤1例，食管癌1例，尤文氏肉瘤1例,非霍奇金淋巴瘤1例，原发部位不明的恶性胸膜积液13例所有患者中，结核性胸膜炎组患者年龄低于非结核性胸腔积液组，男性比例也偏高。2.胸腔积液dPCR

8、检测范围和可重复性。IS6110-dPCR在2.3-82067拷贝/20l反应体系、ISlO81-dPCR在3.0-27520拷贝/20l反应体系的动态范围内，实际检测到的靶标数量与预期靶标数量之间具有很好的相关性(R2均为0.99不同浓度的模板分别进行两次dPCR检测结果的变异系数分析表明，IS6110和IS1081两个靶标的dPCR检测具有较好的可重复性。3.胸腔积液dPCR检测结果。IS6110和IS1081的dPCR检测结果高度相关(r=0.838,P0.0001),同T分结核性胸膜炎样本中检测到的IS6110拷贝数通常多于IS1081(P0.00011结核性胸膜炎组检测到的靶标拷贝数

9、中位数(最小值，最大值)明显高于非结核性胸腔积液组:156110,4.3(0.0,9990.0)和0.0(0.0,2.6)拷贝/20l反应体系，P0.0001;IS1081,1.5(0.0,2020.0)和0.0(0.0,2.1)拷贝/20l反应体系，P0.0001o确诊结核性胸膜炎组检测到的靶标拷贝数中位数(最小值，最大值)明显高于临床诊断组：IS6110,9.9(0.0,9990.0)和1.1(0.0,641.0)拷贝/20l反应体系，P0.0001;IS1081,3.5(0.0,2020.0)和0.9(0.0,191.0)拷贝/20l反应体系lP0.0001o4.胸腔积液dPCR检测对结

10、核性胸膜炎的诊断性能。IS6110-dPCR的ROC曲线下面积大于ISlO81-dPCR0.85(95%CI:0.800.89)和0.79(95%CI:0.750.84),P=0.002o确诊结核性胸膜炎组ROC曲线下面积大于临床诊断组。以每20l反应体系中2.6(IS6110)和2.1(IS1081)拷贝为界值，IS6110-dPCR诊断结核性胸膜炎的总敏感度高于IS1081-dPCR(57.4%和40.4%,P0,001),特异度均为100%。dPCR诊断确诊结核性胸膜炎组的敏感度高于临床诊断缎IS611071.7%和42.9%;IS1081,56.5%和24.2%IS6110或IS108

11、1-dPCR(其中一个靶标阳性定义为阳性，两个靶标均为阴性定义为阴性)诊断结核性胸膜炎、确诊结核性胸膜炎和临床诊断结核性胸膜炎的总的敏感度分别为59.0%、72.8%和45.1%,特异度均为100%。5.胸腔积液IS6110或IS1081-dPCR与其他方法的敏感性比较。胸腔积液的6110或IS1081-dPCR诊断结核性胸膜炎的敏感度明显高于胸腔积液涂片镜检(57.4%和7.1%分枝杆菌培养(55.3%和31.8%)和Xpert(57.6%和23.0%)三种病原学检测方法(P值均0.001与免疫学方法相比，胸腔积液的IS6110或IS1081-dPCR检测敏感度低于外周血T-SPOT.TB检

12、测(58.8%和91.9%,P0.001),但高于夕卜周血和胸腔积液MTB抗体检测（60.7%和42.9%,P=0.002;71.5%和40.4%,P=0.002X其与胸膜活检联合抗酸杆菌检测或胸腔积液ADA测定（界值为40U/L）诊断结核性胸膜炎的敏感度差异均无统计学意义（58.8%和47.1%,P=0.727;64.2%和70.1%,P=0.3586.结核性胸膜炎dPCR检测阴性结果的风险因素分析。多元logistic回归模型分析显示，长抗结核治疗时间（1个月）是结梭性胸膜炎dPCR检测阴性结果的独立风险因素（OR=3.541,P=0.025抗结核治疗1个月样本组中dPCR检测到的靶标数量和阳性率均高于抗结核治疗1个月样本组。研究结论胸腔积液IS6110或IS1081-dPCR检测是一种准确的、可提供MTB病原学证据的分子生物学检测方法，其敏感度高于临床上常用的病原学诊断方法，有改善结核性胸膜炎诊断的潜力。