酶免疫分析技术.ppt

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1、第七章酶免疫分析技术,目录,返回总目录,3,酶免疫分析技术的分类,克隆酶供体免疫测定,酶免疫分析技术,酶免疫组织化学技术,酶免疫测定技术,均相酶免疫测定,非均相酶免疫测定,酶放大免疫测定技术,液相酶免疫测定,固相酶免疫测定,第一节 概述,一、基本原理,酶免疫分析技术的原理是利用酶标记抗体(抗原)形成酶标抗体(抗原)结合物，此结合物既保留抗体(抗原)的免疫活性，又保留了酶对底物的催化活性。酶标抗体(抗原)与相应抗原(抗体)进行反应后，酶催化相应的底物显色，借助酶作用于底物的显色反应来判定结果。,二、酶和酶底物,标记酶的要求：活性高，纯度高作用专一性强性质稳定，易与抗原或抗体偶联测定方法简便易行、

2、敏感、精确酶和底物对人体无害酶和底物价廉易得,（一）辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase,HRP）,2.糖蛋白（主酶）亚铁血红素（辅基）主酶与酶活性无关 辅基是酶的活性中心,3.RZ值：403nm(辅基)与275nm(主酶)OD值之比,4.RZ值与酶活性无关，酶活性单位比RZ值更为重要,1.ELISA中应用最为广泛的标记用酶,DH2十H2O2D十2H20,HRP催化的反应式为：,DH2为供氢体，习惯称为底物，H2O2为受氢体,HRP对受氢体的专一性很高，作用底物有多种。,OPD反应后显橙黄色，加酸终止反应后呈棕黄色，测定波长492nm。不稳定，有致癌性。,TMB反应后显

3、蓝色，加酸终止反应后变为黄色,测定波长450nm，稳定，无致癌性，ELISA中应用最广泛的底物。,（二）碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，AP),是一种磷酸酯水解酶，从大肠杆菌提取,AP的 底物,对-硝基苯磷酸酯（pNPP）,经AP作用后的产物为黄色对硝基酚，最大吸收峰波长为405 nm。,（三）-半乳糖苷酶（-galactosidase，-Gal）,源于大肠埃希菌，常用于均相酶免疫测定。,-Gal的底物,4-甲基伞酮基-D半-乳糖苷（4MUG）,酶作用后，生成高强度荧光物，用荧光计测量。,（四）其他酶,在商品试剂中，经常应用的酶还有葡萄糖氧化酶、6-磷酸葡萄糖脱氢酶、溶菌

4、酶、青霉素酶、脲酶、苹果酸脱氢酶等。,三、酶标抗体(抗原)的制备,制备要求：,抗原要求纯度高、抗原性强。,抗体则要求特异性强、效价高、亲和力强、易于分离纯化和批量生产。,（一）常用的标记方法,标记方法要求：,方法简单，产率高不影响酶和抗体(抗原)的生物活性所得酶结合物稳定，本身不发生聚合较少形成酶与酶、抗体与抗体或抗原与抗原的 聚合物,1过碘酸钠氧化法,仅用于HRP的标记。可与抗体蛋白的游离氨基结合，形成HRP-CH2-NH-IgG。此法酶标记物产率较高，但纯化后仍有少量游离IgG，部分结合物可能聚合，抗体的活性可能有所降低。,2戊二醛交联法,戊二醛分子中有两个相同的醛基，可分别与酶和抗体（抗

5、原）分子上的氨基结合。该法有一步法和二步法。二步法标记效率比一步法高，酶标记物质量较均一。,（二）酶标记物的纯化与鉴定,1酶标记物的纯化,标记完成后应除去反应溶液中的游离酶、游离抗体(抗原)、酶聚合物及抗体(抗原)聚合物，避免游离酶增加非特异显色以及游离抗体(抗原)的竞争作用。,常用的纯化方法有葡聚糖凝胶层析法和饱和硫酸铵沉淀法等。,2.酶标记物的鉴定,（1）免疫活性鉴定：常用免疫电泳或双向免疫扩散法，出现沉淀线表示结合物中的抗体(抗原)具有免疫活性。,（2）酶标记率测定：用分光光度法分别测定结合物中酶和抗体(抗原)蛋白的含量，然后按公式计算其标记率。,四、固相载体,（一）固相载体的要求,结合

6、抗体(抗原)的容量大，结合稳定；可结合抗原或抗体及亲和素或链霉亲 和素等大分子；固相化后分子仍应保持活性；固相化方法应简便、快速。,（二）固相载体的种类,1塑料制品 由聚苯乙烯、聚氯乙烯制成。形状 主要有微量反应板、小试管和小珠三种。,2微颗粒 微颗粒是由高分子单体聚合成的微球 或颗粒。,3.微孔虑膜 是一种多孔薄膜过滤材料，包括硝酸 纤维素膜（NC）、尼龙膜和玻璃纤维素膜等。,微量反应板,返回章目录,第二节 酶联免疫吸附试验,一、基本原理,将已知抗原或抗体吸附在固相载体表面，使抗原抗体反应在固相表面进行，用洗涤的方法将固相上的抗原抗体复合物与液相中的游离成分分开。加入酶的底物后，通过酶对底物

7、催化的显色反应程度，对标本中抗原或抗体进行定性或定量。,二、酶联免疫吸附试验的类型,（一）双抗体夹心法检测抗原,将己知抗体包被固相载体，待检标本中的相应抗原与固相表面的抗体结合，洗涤去除未结合成分。然后再与抗原特异的酶标抗体结合，形成固相抗体-抗原-酶标抗体复合物，根据加底物后的显色程度确定待检抗原的含量。,1.原理,双抗体夹心法检测抗原,（1）将特异性抗体包被于固相反应板上，洗涤。（2）加待检标本,温育，洗涤。（3）加酶标抗体，洗涤。（4）加底物，根据颜色反应的程度进行该抗原的 定性或定量。,2技术要点,（+）,双抗体夹心法测抗原,双抗体夹心法中，应注意类风湿因子(RF)的干扰。如果待检标本

8、中含有RF，可能产生假阳性结果。使用抗体的F(ab)2或Fab片段作为酶标抗体可消除RF的干扰。,3注意事项,（二）双位点一步法检测抗原,即在双抗体夹心法基础上使用针对抗原分子上两个不同表位的单克隆抗体，分别作为固相抗体和酶标抗体。测定时将待检标本和酶标抗体同时加入进行反应，两种抗体互不干扰，经一次温育和洗涤后，即可加入底物进行显色测定。,1原理,双位点一步法检测抗原,3.加酶作用的底物显色,2.加待检抗原和酶标抗体,1.已知抗体包 被载体,Y,Y,Y,Y,E,Y,Y,E,Y,Y,Y,E,Y,Y,E,Y,Y,（+）,3.加酶作用的底物不显色,2.加待检物（无抗原）和酶标抗体,1.已知抗体包 被

9、载体,Y,Y,Y,Y,E,Y,Y,E,Y,Y,（-）,Y,Y,Y,双位点一步法测抗原,如果待检标本中抗原浓度过高，容易形成“钩状效应（hook effect）”。钩状效应严重时，可出现假阴性结果，必要时可将待检标本适当稀释后重新测定。,2注意事项,（三）竞争法检测抗原,酶标抗原和待检抗原对固相特异性抗体具有相同的结合力，二者竞争结合固相特异性抗体。免疫反应后，结合于固相的酶标抗原量与标本中待检抗原含量呈反比。待检抗原量越多，酶标抗原与固相抗体结合越少，底物显色反应越浅；反之则显色越深，即底物显色与待检标本中抗原含量呈反比。,1原理,酶标抗原,竞争法检测抗原,（1）将特异性抗体包被于固相反应板上

10、，洗涤。（2）待测管中加待检标本和一定量酶标抗原的混合溶液，待检标本中如果含有抗原，则与酶标抗原竞争固结合相抗体，使酶标抗原与固相载体的结合量减少。对照管中只加酶标抗原，温育，洗涤。（3）加底物显色。对照管中颜色深，待测管颜色越淡，表示标本中抗原含量越多。,2技术要点,竞争法测抗原,（四）间接法检测抗体,将已知抗原吸附于固相载体上，待检标本中相应抗体与之结合，形成固相抗原-抗体复合物，再用酶标二抗与固相免疫复合物中的抗体结合，形成固相抗原-抗体-酶标二抗复合物，根据加底物后的显色程度确定待检抗体含量。,1原理,间接法检测抗体,（1）将特异性抗原包被于固相反应板上，洗涤。（2）加稀释的受检血清，

11、洗涤。（3）加酶标二抗，洗涤。（4）加底物显色，颜色深度代表标本中待检抗体 的量。,2技术要点,间接法测抗体,（五）双抗原夹心法检测抗体,将已知抗原包被固相载体，待检标本中的相应抗体可分别与固相表面的抗原、酶标抗原结合，形成固相抗原-抗体-酶标抗原复合物，根据加底物后的显色程度确定待检抗体含量。,同双抗体夹心法。,1原理,2技术要点,双抗原夹心法检测抗体,4.加酶作用的底物 不显色,双抗原夹心法测抗体,（六）竞争法检测抗体,同竞争法结合抗原。,HBcAb和HBeAb的测定均采用竞争法，但其测定具体模式有区别。,1原理,（1）竞争法检测HBcAb：将HBcAg包被于固相反应板上，洗涤。加入待检标

12、本和酶标特异性抗体，温育，洗涤。加入底物，温育，形成有色产物，用酶标比色仪测定结果。显色深浅与待检标本中相应抗体含量成反比。,2技术要点,竞争法检测HBcAb,3.加酶作用的底物显色,3.加酶作用的底物显色,2.加待检抗体 和酶标抗体,1.已知HBcAg包 被载体,（+）,Y,Y,Y,Y,Y,E,2.加待检物（无抗体）和酶标抗体,1.已知HBcAg包 被载体,（-）,Y,Y,Y,E,Y,Y,Y,E,E,E,E,E,竞争法检测HBcAb,（2）竞争法检测HBeAb：将HBeAb包被于固相反应板上，洗涤。加入待检标本和HBeAg，温育，洗涤。加入酶标HBeAb，温育，洗涤。加入底物，温育，形成有色

13、产物，用酶标比色仪测定结果。显色深浅与待检标本中相应抗体含量成反比。,竞争法检测HBeAb,竞争法检测HBeAb,（七）捕获法检测抗体,将抗人IgM抗体吸附于固相载体上，待检标本中的IgM类抗体多被固相抗体捕获。加入特异抗原与固相抗体捕获的IgM类抗体结合，再加入抗原特异的酶标抗体，形成固相抗人IgM-IgM-抗原-酶标抗体复合物。最后根据加底物后的显色程度确定待检IgM抗体的含量。,1原理,（1）将抗人IgM链抗体包被于固相反应板上，洗涤。（2）加人待检标本，温育，洗涤。（3）加入特异性抗原，温育，洗涤。（4）加入抗原特异的酶标抗体，温育，洗涤。（5）加入底物，温育一定时间，显色，用酶标 比

14、色仪测定结果。,2技术要点,固相捕获法检测lgM抗体,5.加酶作用的底物不显色,捕获法,采用固相捕获法检测IgM类抗体时要注意的是RF（IgM类）及其它非特异IgM的干扰。RF（IgM类）能与固相抗人链抗体结合，并可与随后加入的酶标抗体（动物IgG）反应，从而导致假阳性反应。,3注意事项,非特异IgM由于其在第一步温育中，可与特异IgM竞争与固相抗体结合，所以会影响测定的灵敏度。因此，使用本法测IgM，必须对临床样本进行适当稀释。,三、最适工作浓度的选择,（一）间接法检测抗体,（1）用100ng/ml人IgG进行包被，洗涤。（2）将酶标抗人IgG用稀释液作一系列稀释后分别加入已包被的孔中，温育

15、，洗涤。（3）加底物显色。加酸终止反应后，读取吸光度（A）值在1.0时的酶标抗体稀释度，作为酶标抗体的工作浓度。,1酶标抗抗体工作浓度的选择,（1）用包被液将抗原作一系列稀释后包被，洗涤。（2）将强阳性参考血清、弱阳性参考血清和阴性参考血清用稀释液作1:100稀释，加样，温育，洗涤。（3）加按工作浓度稀释的酶标抗人IgG抗体，温育，洗涤。,2棋盘滴定法选择包被抗原工作浓度,（4）加底物显色，加酸终止反应后读取A值。（5）选择强阳性参考血清的A值为0.8左右，阴性参考血清的A值小于0.1的包被抗原的稀释度作为工作浓度。,间接ELISA法包被抗原最适工作浓度的选择,（二）双抗体夹心法检测抗原,（1

16、）抗体用包被缓冲液稀释至浓度为10、1和0.1g/ml，分别在ELISA板上进行包被，洗涤。（2）在一个横行各包被孔中加入强阳性抗原液，另一横行加入弱阳性抗原液，第三横行加入阴性对照液，温育，洗涤。,（3）将酶标抗体用稀释液稀释成三个浓度，例如1:1000、1:5000和1:25000。温育，洗涤。（4）加底物显色，加酸终止反应后，读取A值。（5）以强阳性抗原的A值在0.8左右、阴性参考的A值小于0.1的条件作最适条件，据此选择包被抗体和酶标抗体的工作浓度。,返回章目录,夹心ELISA包被抗体和酶标抗体工作浓度的选择,第三节 酶联免疫吸附试验的应用和注意事项,一、应用,1病原体及其抗体测定 广

17、泛应用于传染病的诊断。2蛋白质测定 各种免疫球蛋白、补体组分、肿瘤标志物各种血浆蛋白质、同工酶等。,3非肽类激素测定 如T3、T4、雌激素、绒毛膜促性腺激素、黄体素、胰岛素、皮质醇、促甲状腺素等。4药物和毒品测定 如地高辛、苯巴比妥、庆大霉素、吗啡等。,1加样 应力求准确，并注意不可溅出和产生气泡。2温育 注意反应的温度和时间应按规定的要求，整块反应板的温度应一致，以防止“边缘效应”。3洗涤 手工洗板是在每次温育后，将反应液吸出或甩干，然后用缓冲液洗涤2或3次，拍干。使用洗板机洗涤次数要适当增加。,二、注意事项,4显色 根据试剂盒说明操作即可。5比色 要注意波长的选择。操作中应注意避免出现滤光

18、片错用的问题。,返回章目录,第四节 其他酶标记免疫测定技术,一、均相酶免疫测定法、固相模免疫测定法等,基本原理 酶标抗原和非标记抗原具有相同的与限量抗体竞争结合的能力，而酶标抗原与抗体结合形成酶标抗原-抗体复合物后，其中的酶活性将被减弱或增强。,（一）均相酶免疫测定法,因此，不需对反应液中结合和游离的酶标抗原进行分离，直接测定反应系统中总酶活性的变化即可推算出被测样品中抗原的含量。,（二）非均相液相酶免疫测定法,基本原理：将酶标抗原、待检抗原与特异性抗体同时混合（平衡法），或先将待检抗原与特异性抗体混合反应一定时间后，再加入酶标抗原（非平衡法），抗原抗体反应达到平衡后，加入二抗，经离心沉淀后，

19、将游离的酶标记物与结合的酶标记物（酶标抗原-抗体-二抗复合物）分离，弃上清液，测定沉淀物中酶的活性。待检抗原量与沉淀物中酶的活性成反比。,（三）固相膜免疫测定法,1.斑点酶免疫吸附试验,基本原理与常规ELISA相同，不同之处在于Dot-ELISA使用吸附蛋白质能力很强的NC 膜为固相载体，底物经酶反应后形成有色的沉淀物，使NC 膜染色。,斑点-酶联免疫吸附试验,2.免疫印迹试验,原理,抗原等蛋白样品经SDS处理后带阴电荷，在聚丙烯酰胺凝胶中从阴极向阳极泳动。将在凝胶中已经分离的蛋白质条带转移至NC腹上，选用低电压(100v)和高电流(12A)，通电45min转移即可完成。,印有蛋白条带的NC膜

20、依次与特异性抗体和酶标二抗作用后，加入能形成不溶性显色物的酶反应底物，使区带染色。阳性反应的条带染色清晰，根据SDS-PAGE时加入的分子量标准，确定各组分的分子量。,免疫印迹试验,免疫印迹试验,3.重组免疫结合试验,基本原理与免疫印迹试验相似，不同之处是特异性抗原不通过电泳分离转印，而是直接分条加在固相膜上。RIBA已用于血清抗HCV抗体的测定和分析。,二、生物素-亲和素标记技术在 ELISA中的应用,（一）生物素和亲和素的特点,结构中的咪唑酮环是与亲和素结合的主要部位，四氢噻吩环戊酸侧链末端羧基是与抗体和酶等蛋白质结合的主要部位。,1生物素(biotin，B),利用生物素的羧基加以化学修饰

21、后可制成各种活性基团的衍生物(活化生物素)，以适合与各种生物大分子结合的需要。,富含色氨酸，借助色氨酸残基与生物素的咪唑酮环结合。亲和素与生物素之间的亲和力极强，比抗原与抗体的亲和力至少高1万倍，且具有高度特异性和稳定性。,2亲和素(avidin，A),酸性氨基酸含量较多，其等电点为pH值6.0，而且不带任何糖基，在检测中出现的非特异性结合明显少于卵白亲和素，正逐渐取代卵白亲和素。,3链霉亲和素(streptavidin，SA),生物素-亲和素技术在ELISA中的应用类型,A为标记亲和素 B为标记生物素,基本原理：直接BA-ELISA是以酶标亲合素直接连接生物素化抗体。间接BA-ELISA采用

22、生物素化的二抗，可进一步提高检测灵敏度。BA-ELISA中亲和素与酶的共价结合对酶的活性有一定程度的损伤。,1.BA-ELISA,BA-ELISA检测抗原,BA-ELISA检测抗体,基本原理：直接BAB-ELISA是以游离的亲合素作为桥联剂，利用亲合素的多价性，将生物素化抗体和酶标生物素连接起来，以检测反应分子。间接BAB-ELISA是在加入抗体后，再用生物素化的二抗，使反应增加一个层次，从而使灵敏度进一步提高。,2BAB-ELISA,BAB-ELISA,基本原理：亲合素与酶标生物素结合形成亲合素-生物素-过氧化物酶复合物(ABC)。当其与生物素化抗体(直接ABC-ELISA)或生物素化二抗(

23、间接ABC-ELISA)相遇时，ABC中未饱和的亲合素结合部位可与抗体上的生物素结合，使抗原抗体反应体系与ABC体系连成一体。通过依次的相互连接作用，形成一个具有多级放大作用的晶格样网状结构，使检测敏感性明显提高。,3ABC-ELISA,返回章目录,ABC-ELISA,小 结,酶免疫分析技术是以酶标记的抗原或抗体作为主要试剂的免疫检测方法，在抗原与抗体的特异性反应完成后，通过酶对底物的催化作用提高反应的敏感性。酶免疫分析技术可分为酶免疫组织化学技术和酶免疫测定两大类,后者根据抗原抗体反应后是否需要分离结合与游离的酶标记物而分为均相和非均相两种类型。,最常用的技术是以聚苯乙烯等材料作为固相载体的

24、酶联免疫吸附试验（ELISA）,其原理可分为夹心法、竞争法、间接法和捕获法等。,返回章目录,展 望,酶免疫技术是三大经典标记免疫技术之一，是以酶标记抗体或抗原为主要试剂的一种标记免疫分析技术。随着相关新技术的不断问世，如杂交瘤单克隆抗体、生物素一亲和素放大系统的应用以及与化学发光和电化学发光技术的偶联等，明显地提高了分析和测定方法的特异性、灵敏度及其自动化程度，使酶免疫分析技术不断更新，应用范围不断拓宽。,当前，酶免疫技术己与形式各异、各具特点和用途的定位、定量和超微量测定的标记免疫技术融合发展，在医学和生物学中有着广泛的应用。,返回章目录,THANK YOU FOR YOUR ATTENTION!,返回总目录,