2023欧洲疾病预防控制中心《百日咳鲍特菌的实验室诊断和分子监测》解读.docx

《2023欧洲疾病预防控制中心《百日咳鲍特菌的实验室诊断和分子监测》解读.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《2023欧洲疾病预防控制中心《百日咳鲍特菌的实验室诊断和分子监测》解读.docx（12页珍藏版）》请在课桌文档上搜索。

1、2023欧洲疾病预防控制中心百日咳鲍特菌的实验室诊断和分子监测解读摘要百日咳是一种极具传染性的急性呼吸道感染性疾病，尽管已广泛开展了儿童疫苗接种，但并不能由此获得终身免疫。为应对百日咳在世界流行的挑战，2022年12月21日欧洲疾病预防控制中心发布了百日咳鲍特菌的实验室诊断和分子监测，详细描述了百日咳实验室诊断和分子监测的方案，值得我国从事百日咳诊疗的医护人员和技术人员研究学习，现介绍并解读该文件的主要内容。关键词百日咳鲍特菌；实验室诊断；分子监测百日咳是由百日咳鲍特菌(8ode/aPess/M)引起的具有高度传染性的呼吸道疾病,全年龄段人群均可感染发病。自20世纪50年代起，随着百日咳疫苗的

2、广泛接种，百日咳发病率显著降低，但近年来，一些疫苗接种率较高的国家和地区相继报道百日咳发病率逐渐上升，称为百日咳再现【1。但国家之间监测的百日咳流行病学变化特征并不一致，不同国家推广的百日咳检测方法和应用策略存在显著差异21,削弱了百日咳发病数据之间的可比性。2022年12月21日欧洲疾病预防控制中心(EuropeanCentreforDiseasePreventionandControl,ECDC)发布了百日咳鲍特菌的实验室诊断和分子监测3),不仅详细描述了百日咳实验室诊断，包括细菌培养、核酸检测、抗原鉴别以及血清鉴定的方法，而且对相关的分子监测，如抗原序列分析和基因组测序等方法加以阐述，值

3、得我国从事百日咳诊疗的医护人员和技术人员研究学习，本文介绍并解读该文件的主要内容。1标本的采集与转运百日咳鲍特菌主要在人的鼻咽部生长繁殖，可从鼻咽拭子(nasopharyngealSWab,NPS)或鼻咽抽吸物(nasopharyngealaspirate,NPA)标本中分离。NPA是临床上常见的呼吸道感染病原体检测标本，且可分成等份并保存，易于多个研究共享，但收集以门诊就诊为主的年长儿、青少年和成人的NPA标本较难，因此除了婴幼儿住院患者，NPS更易于采集。止匕外，由于需要患儿及其家属更长时间的配合，临床上采集到合格的NPA标本更为困难，相对而言，NPS采样更加方便快捷，接受度更高。因此，作

4、者所在团队2000年以来，一直采用NPS进行百日咳鲍特菌分离培养和核酸检测。NPS采样技术在新型冠状病毒病疫情期间也得到了推广和普及。用于百日咳鲍特菌分离培养和特异核酸检测标本最佳的采集时间为咳嗽出现后的3周内ML世界卫生组织推荐咳嗽病程1个月内适宜百日咳病原学诊断【5】。如有可能，室温下采集的拭子应立即接种，如需转运，4h内运送到微生物实验室进行培养；如置于含有木炭的ReaganLowe(RL)、Amies培养基中或通用运输培养基中可适当放宽转运时间。建议高温季节时采用冰盒转运。2实验室诊断2.1细菌培养与成人相比，儿童(尤其是婴儿)患者的NPS中百日咳鲍特菌DNA含量更高，因此，百日咳婴幼

5、儿一般采用细菌培养或核酸扩增的方法辅助诊断。对咳嗽持续时间21d的百日咳疑似病例采集NPS,并划线接种到补充有15%去纤维蛋白绵羊血或马血的新鲜RL或鲍-金培养基(Bordet-Gengoumedium,BG),RL和BG平板上的百日咳分离率相似。BG的主要优点是观察溶血更为方便。由于百日咳鲍特菌为苛养型革兰阴性球杆菌，且生长速度慢，因此通常要加入选择性培养基添加物-头抱氨节以抑制其他细菌的生长。接种标本的平板应置于35-36有氧条件下培养7d,并每天检视,3d后若见灰白色、圆形、半透明水银滴样的细小疑似菌落，可以采用特异性血清凝集试验或聚合酶链反应(PCR)加以鉴定，也可以借助基质辅助激光解

6、吸电离飞行时间质谱进行确认。过夜培养就可见的疑似菌落可能是副百日咳鲍特菌，也应进行鉴定确认。培养7d后没有可疑菌落生长的平板可以培养阴性处理。为避免平板干燥，孵箱内需保持湿度在60%左右。传统的细菌培养，虽然检测特异度高，也可以用于评估其抗生素的耐药性，但由于操作的复杂性，结果容易受到标本的采取手法，实验室的培养条件等因素的影响，其阳性检出率低。2.2核酸检测核酸检测受抗生素使用的影响较细菌培养小，咳嗽病程短于4周(256mg/L或纸片抑菌直径35mm0大环内酯类耐药机制是百日咳鲍特菌23SrRNA基因结构域V中2047位(A2047G)核昔酸A改变为G的点突变。3.3脉冲场凝胶电泳2000年

7、，百日咳领域的专家基于XbaI和SPel两种酶建立了百日咳鲍特菌的脉冲场凝胶电泳(pulsed-fieldgelelectrophoresis,PFGE)的参考方法211,用来分析分子大小在23和500kb之间的条带，具体信息可以参考网站：http:/www.pasteur.fr/recherche/unites/Bordetella/Analysis.html一项2012年至2015年的研究在欧洲百日咳鲍特菌中发现了PFGE谱型发生明显变化，BpSR3(29.4%)和BPSRIo(27.2%)变得普遍，而以前占主导地位的BpSR11和其他谱的数量和占比下降22。PFGE不仅可以观察到菌株谱，

8、也可以鉴别不同地区和/或不同时间的流行菌株之间的差异。在aP或WP疫苗免疫的人群中，感染菌株的PFGE谱也有所不同。但该方法要求分析的样品为活菌，且需要对细菌进行传代培养。3.4多位点抗原序列分型(multi-locusantigensequencetypingfMAST)MAST主要研究百日咳鲍特菌5个表面功能蛋白PT、丝状血凝素(FHA)、PRN、Fim2和Fim3的编码基因。这些蛋白具有很强的免疫原性，因此也成为百日咳疫苗的重要的组分。其中PtxP虽然不直接编码疫苗成分，但其等位基因型ptxP3与PT和其他毒力因子的分泌增加有关，故也被列入了该分型。因此可以根据PT的A亚基(ptA)、p

9、txP、百日咳黏附素(PrrI)、fim2和fim3等基因进行基因分型，将测序所得等位基因提交到http5：PUbMl5t.0rg/进行序列比对。PT由5个亚单位组成(PtxA-PtxE),其中PT的酶催化活性存在于PtxA亚基中。研究表明，PT增加了百日咳鲍特菌感染的严重程度，与百日咳鲍特菌密切相关的副百日咳鲍特菌因为不产生PT,通常不会导致严重感染123。PtxA基因包含810个碱基，迄今已发现13个等位基因(ptxpA1-ptxpA13),目前，国内也表现出与欧盟/欧洲经济区等地方相似的流行情况,ptA1在分离株中占主导地位18,24J996年至2018年法国已经鉴定了5个PT缺陷分离株

10、，研究发现3株是由于整个PT操纵子的缺失，另外2株分别是由于ptS4中7个核昔酸的缺失和ptS1亚基中1个核昔酸的缺失导致没有表达PT25.FHA基因(仍a句包含约12000个碱基，由于其庞大的序列，该基因的常规测序尚未进行。虽全基因组测序(wholegenomesequencing,WGS)描述了fhaB3等位基因，揭示了其更多的多态性，但后续fhaB等位基因相关的报道很少。PRN是百日咳鲍特菌暴露于细菌表面的外膜蛋白(OUtermembraneprotein,OMP),其既是百日咳鲍特菌的毒力因子，又能作为抗原诱导机体产生保护性抗体。PRN是在百日咳鲍特菌中发现的最具多态性的基因之一,迄今

11、已鉴定了18个等位基因，其中pr1和prn7等位基因在疫苗前时期占优势，在欧盟/欧洲经济区，prn2是目前的主要流行型别，95%的流行百日咳分离株具有这种基因型。国内流行临床菌株中的prn基因型与西方国家有所不同，以prn1最为常见26。从实施全细胞百日咳疫苗(WPV)免疫接种迈入无细胞百日咳疫苗(APV)接种时期后，缺乏PRN的百日咳分离株开始出现并在高疫苗覆盖率地区进行传播。在欧洲9个国家(比利时、丹麦、芬兰、法国、意大利、荷兰、挪威、瑞典和英国)进行的一项研究显示，PRN缺陷型分离株从1998年至2001年的1.0%显著增力到2012年至2015年的25.0%,澳大利亚、日本和美国也出现

12、了类似的增长【27】。百日咳鲍特菌基因组发生多个突变可导致不表达PRNo近期，有研究首次在国内报道了prn缺失型百日咳鲍特菌分离株24,该现象需持续关注。Fim是百日咳鲍特菌表面的一种丝状聚合蛋白，由4个主要的菌毛(Fim)亚单位(FimA、FimX、Fim2和Fim3)和1个次要亚单位(FimD)组成,可增强细菌对宿主细胞的黏附。其中，虽然Fim2和Fim3的氨基酸序列同源性超过60%,均能诱导抗原特异性抗体，但二者之间并无交叉反应。Fim2-1和Fim2-2等位基因均是在前疫苗时代的分离株发现的，但随着Fim2-2临床分离株中在当代临床分离株被发现，表明该突变已再次流行。但国内多项研究表明

13、，我国流行株仍以Fim2-1为主口7,28L目前已鉴定出19种ptP等位基因。在疫苗前时代，携带ptP1和ptxP2等位基因的分离株占优势，引入疫苗后，百日咳鲍特菌菌株基本上以ptxP1型别为主。然而随着时间的变化，百日咳流行菌株对疫苗相关抗原基因已出现适应性变化，欧盟/欧洲经济区出现了较ptxP1型百日咳鲍特菌产生更高水平PT的ptxP3型菌株。美国、中国等其他国家也报道存在ptP3型菌株，在部分地区是主要型别29-30。3.5多位点可变数目串联重复序列分析(VariabIenumberoftandemrepeatfVNTR)VNTR通过区分基因组上多个VNTR的重复数来区分菌株，每个VNT

14、R基因座的重复数通常通过使用PCR扩增每个基因座并测量扩增产物的长度来确定。MLVA量化了每个分离物中几个VNTR位点的串联重复数，可用于流行病学溯源分析。自大规模疫苗接种后，国外的研究表明MLVA型MT27和MT29分离株随着时间的推移越来越流行，携带ptP3的MT27已成为大多数发达国家的主要毒株E-32。目前，国内对MLVA型别的研究还不多见，Xu等33对我国1950年至2007年间从临床上分离到的百日咳鲍特菌进行了MLVA分析，发现主流MLVA呈现动态变化，此外，还发现百日咳鲍特菌种群的进化与国家疫苗接种覆盖率密切相关。近期，Wu等34在国内首次发现2株属于MT28和MT27的ptxP

15、3-耐红霉素百日咳菌株。Fu等35随后报道了MT28ptxP3-耐红霉素百日咳菌在上海地区传播和流行的情况。3.6WGSWGS对分离株之间的遗传差异有较高的分辨率，为百日咳鲍特菌致病性和疫苗时代菌株基因组进化研究提供新的线索。WGS需要高质量提取细菌DNAe紫外分光光度法或荧光法测量260/280和260/230吸光度比率来确保模板质量，应使用260/280比率和260/230比率大约分别维持在1.8和2.0-2.2的DNA样品，可用凝胶电泳和荧光方法分别来验证DNA的数量和完整性。WGS可以通过短读测序仪和长读测序仪来实现，短读测序仪并行产生数百万个范围在50-400个碱基对之间的原始读数，

16、成本低廉，并能提供高度准确的结果，适用百日咳鲍特菌的分子分型、毒力相关基因检测、暴发调杳和表型预测，但针对含有大批重复GC区域的百日咳鲍特菌，短阅读WGS分型存在困难。长读测序仪通过产生大于Wkb序列的读取则可以很好地克服这些问题，但相应会较短读测序仪有更高的错误率。WGS适用于生物学研究的各个领域，然而相应的成本以及缺乏操作和质量控制，以及分析流程的统一规范，阻碍了该技术在常规监测中的应用。探索基因组多样性最流行的方法是将等位基因视为分析单位的逐个基因方法,将基因组序列上传到细菌分离物基因组序列数据库（BIGSdb）,百日咳鲍特菌基因组序列数据库可在https:bigsdb.pasteur.

17、fr/bOrdeteIla/获得，可以针对所有已知的百日咳鲍特菌关键靶标的等位基因进行扫描，产生的等位基因谱可以通过基因组比较进行分析。4小结综上所述，应根据疑诊患者的年龄、病程等临床特征选择细菌培养、核酸检测或血清学等实验室检测方法辅助百日咳诊断。细菌培养是百日咳诊断的金标准，特异性高；此外，培养获得的分离株可以用于百日咳种群变化的分子监测，监测大环内酯类抗生素耐药性，对于评估疫苗有效性和未来疫苗开发也非常重要，ECDC强烈推荐。但细菌分离培养的敏感性较低，周期较长，易受外界因素影响，如患者已使用抗生素或样本装运、保存条件不当等。与细菌学和血清学方法相比，核酸检测方法对不符合临床诊断标准的非

18、典型病例、隐性感染者引起的百日咳有着较高的敏感性和特异性。血清学方法是青少年和成人百日咳最常用的检测方法，使用商业试剂盒测定抗PT-IgG抗体，采用国际标准并使用适当的临界值对结果进行解释和分析。自从APV疫苗代替WPV疫苗以来，百日咳鲍特菌抗原基因多态性发生变化，不表达PRN的分离株已在全球进行流行，对流行百日咳菌株的分子监控的工作就显得十分重要。最简单也是最古老的百日咳鲍特菌分型方法是血清分型，但因只能区分3种血清型，对解释百日咳菌株流行的作用非常有限。MLVA、PFGE等方法的出现能灵敏地识别新出现的分离株,PFGE方法分析整个基因组，较MAST和MLVA更加稳定且具有高分辨率，但由于缺乏标准化，很难在实验室之间进行比较。WGS的分辨能力最高，可用于分析百日咳所有基因的缺失或多态性,同时借助高通量DNA测序技术，更加精确分析全基因组水平的单核昔酸多态性差异、基因变异分布的规律及其突变率。大环内酯类耐药百日咳鲍特菌分离株目前主要在中国流行，需要从表型和基因型两方面监测这些菌株是否在欧盟/欧洲经济区等地区乃至全世界传播，这不仅是对于百日咳鲍特菌分子水平的动态检测和评估流行病学趋势，更是为百日咳患者的临床预防和有效治疗提供指导。