儿童呼吸道感染病原体核酸检测专家共识重点内容.docx
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1、儿童呼吸道感染病原体核酸检测专家共识重点内容摘要急性呼吸道感染是儿童最常见的感染性疾病,严重威胁儿童生命健康。快速准确的病原学诊断对于该类疾病的临床诊疗及防控具有重要意义。核酸检测方法因具有较高的灵敏度和特异性,得以快速地在临床推广应用,成为呼吸道感染病原体诊断的主要方法。为规范儿童呼吸道感染病原体核酸检测的临床应用,提升病原体的诊断水平,特组织相关领域专家,撰写儿童呼吸道感染病原体核酸检测专家共识,以指导儿童呼吸道感染病原体的核酸检测,整体提升儿童呼吸道感染病原体的诊断能力。关键词儿童;急性呼吸道感染;病原体;核酸检测;共识急性呼吸道感染是儿童最常见的感染性疾病,急性下呼吸道感染是5岁以下儿
2、童病死的首位原因,严重威胁儿童生命健康,对家庭和社会造成了严重的疾病负担1L儿童呼吸道感染的病原复杂多样,包括病毒、细菌、非典型病原体、真菌等(常见病原体见附录近年来,新型冠状病毒、禽流感病毒等新发再发呼吸道感染病原体也对儿童生命健康造成了严重威胁。明确感染病原有助于抗微生物药物的合理使用及呼吸道传染病的早发现、早隔离、早报告和早治疗。因此,快速准确的病原学诊断对于呼吸道常见感染性疾病的临床诊疗及防控具有重要意义。儿童呼吸道感染病原体检测方法包括分离培养、抗原检测、核酸检测和抗体检测等,各种方法均有各自的优缺点。由于病原体分离培养费时费力且敏感性较低,血清抗体检测因有窗口期不推荐使用,故呼吸道
3、感染病原体的主要实验室诊断方法为抗原检测和核酸检测。核酸检测方法因在不同的疾病期均具有较高的灵敏度和特异性而得以快速地在临床推广应用,成为呼吸道感染病原体诊断的主要方法。多重核酸检测的合理使用,不仅有利于儿童呼吸道感染的病原学辅助诊断,同时也会为病原体的鉴别诊断及医院内感染的防控提供强有力的支持;宏基因组测序技术(metagenomicsnextgenerationsequencing,mNGS)为未知病原的明确提供了可能。为规范儿童呼吸道感染病原体核酸检测的临床应用,提升儿童呼吸道感染病原体的诊断水平,实现国家卫生健康委制定的2021年国家医疗质量安全改进目标中提高呼吸道病原核酸检测率的目标
4、,特组织临床微生物学、分子生物学、临床医学及检验医学等各相关领域专家,结合国内外文献最新进展,形成儿童呼吸道感染病原体核酸检测专家共识,以指导儿童呼吸道感染病原体的核酸检测,整体提升儿童呼吸道感染病原体诊断能力.1、呼吸道病原体核酸检测方法病原体核酸检测方法以是否依赖于基因组序列特征分为基因组序列依赖性和非依赖性两类方法。病原体基因组序列依赖性核酸检测方法是根据已知的病原体基因组序列,设计特异性引物,靶向性地进行病原体核酸扩增和检测的方法,如常规的聚合酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)0病原体基因组序列非依赖性核酸检测方法不需要根据病原体基因组序列设计特异性引物
5、,而是对样本中的病原体序列进行高通量测序,将获得的序列与数据库中序列进行比对分析而确定病原体的方法,如mNGS。病原体核酸检测方法按照技术原理又可分为核酸扩增、核酸杂交、基因测序、规律成簇的间隔短回文重复(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats,CRISPR)技术等。核酸扩增包括PCR扩增、等温扩增技术等。以PCR为主的核酸扩增技术因其高效特异、使用灵活、操作相对简单且成本低的优势,成为当前呼吸道病原体核酸检测最普遍的核酸诊断方法。靶向多种病原体的多重标靶设计以及与核酸提取、扩增、结果读取一体化设备的研发应用,凸显核酸检测在病原
6、体多重快速检测方面的优势。覆盖呼吸道感染常见病原体及耐药基因的核酸检测,可为临床提供病原体诊断依据,有助于优化诊疗。根据分析PCR产物的技术平台不同,又可分为荧光法、毛细管电泳法和质谱分析法等,其中荧光法是最常用的方法。核酸杂交,如基因固相和液相芯片技术以及基因测序技术因操作相对复杂,对设备及人员要求高,不适合在临床大规模使用,可根据实际情况选择应用。CRISPR技术是一种新兴的检测手段,尚未在病原核酸检测领域普及。常见的核酸检测方法概述如下。1.1病原体基因组序列依赖性核酸检测方法采用靶向病原体基因组的引物,通过链特异性延伸、杂交、编辑等方式实现靶向目标序列的扩增,获得可被检测到的信号,这是
7、病原体检测常用的技术方法。常用的方法包括以下几类。1.1.1实时荧光定量PCR(real-timePCR)实现了PCR从定性到定量的飞跃,使用荧光报告分子来检测每一轮PCR扩增过程中的产物。该方法将核酸扩增和检测步骤相结合,无需对扩增产物进行凝胶电泳,具有简单、特异性和灵敏性高、重复性好、定量准确、速度快等诸多优点。1.12等温扩增技术该技术具有操作简单、快速、高效、特异、无需专用设备的优点,较适用于基层和现场检测。代表性技术有环介导等温扩增(loopmediatedisothermalamplification,LAMP)和核酸序列依赖性扩增(nucleicacidsequencebased
8、amplification,NASBA)0LAMP使用具有链置换特性的BStDNA聚合酶,在等温条件下高效、快速、特异性扩增靶标序列2基于LAMP技术开发的呼吸道病原体检测方法已有商品化试剂。NASBA技术是一种检测RNA的等温扩增方法,一般在42完成扩增,需反转录酶、RNA酶H、T7RNA聚合酶和序列特异性引物来完成。NASBA尤其适用RNA病毒的检测3-40目前有基于NASBA技术检测常见呼吸道病毒和流感嗜血杆菌、脑膜炎奈瑟菌、肺炎链球菌的方法,用于辅助诊断5-61扩增产物的鉴定可以通过颜色、浊度、胶体金技术或与化学发光、荧光、芯片检测设备结合进行一体化检测。但等温扩增技术扩增体系的稳定性
9、和方法的成熟度不及传统PCR方法。如LAMP技术对引物设计要求高,对扩增靶序列的长度有限制,一般不能进行长片段的扩增;NASBA技术反应体系和组分相对复杂,需要多种酶反应,增加了检测成本。1.1.3核酸即时检测(point-of-caretesting,POCT)技术核酸POCT因快速、自动、整合从细胞裂解、核酸提取扩增到产物分析的全部测定步骤,降低检测复杂性,有效防止交叉污染等优点,是病原学检测最受关注的发展方向7o核酸POCT与real-timePCR方法比较,在敏感性和特异性方面并无显著差异t8L欧美国家核酸POCT产业发展较为成熟9,最为成熟的呼吸道感染病原临床检测是针对耐药型结核杆菌
10、,甲、乙型流感病毒和呼吸道合胞病毒的多联检测体系,覆盖20种以上呼吸道病毒和细菌的多联检测体系正逐步推广。2020年的新冠肺炎疫情推动了病原体核酸POCT的快速发展,严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severeacuterespiratorysyndromecoronavirus2,SARS-CoV-2)被迅速列入各POCT联合检测体系中。高质量国产核酸POCT的临床推广应用和前景仍是目前分子诊断领域发展的热点1011.2病原体基因组序列非依赖性核酸检测方法mNGS是非序列依赖的新型核酸检测方法,是新发突发传染病和临床未知病原体鉴定的重要技术方法。mNGS是用高通量测序平台对感染部位样本中提取的
11、核酸进行高通量测序,通过将测序数据与数据库序列的比对分析,获得样本中包含的病毒、细菌、真菌和寄生虫等的病原微生物种类。该方法不依赖特异性的引物扩增11-12,以非序列依赖、无偏倚性、适用于各种临床样本等特点,在呼吸道感染的病原体检测和研究中具有较其他分子检测技术不可比拟的优势13-150对于儿童呼吸道感染,在病因不明且病情危重需要尽快明确病原体、疑似新发或特殊病原体感染、传统微生物检测技术多次阴性且治疗效果不佳等情况下,可以在常规病原检测的同时或在其基础上对样本进行mNGS分析,以高效获取感染病原体的信息。mNGS在临床的应用仍面临较大的挑战,尤其在呼吸道感染疾病领域14-16o原因包括以下几
12、点:(1)基于mNGS方法的实验操作步骤多且较复杂,有一定技术难度14;(2)宿主或环境噪音信号较多,检测结果容易受到人源宿主及环境物种遗传物质的干扰,影响有效病原体数据的获取17-18(3)mNGS技术检测样本中的核酸包括DNA与RNA),无法完全区分检测到的微生物是否为感染病原体,结果的解释需结合临床综合判断;(4)报告解读复杂,下机数据的分析及结果报告应由临床专业人员结合患儿临床背景、影像学资料、其他的实验室检查结果综合判断其临床意义。此外,mNGS方法的质量控制和标准化评价方法有待完善。由第三方实验室开展的临床样本mNGS检测,需强化过程监管,亟需开展我国病原mNGS临床应用的科学质量
13、评价体系和标准化的评估方法。我国相关监管部门开始建立相关技术标准,强化对mNGS检测产品的规范化19-2002、呼吸道病原体核酸检测推荐人群根据各种核酸检测方法的优缺点,对呼吸道病原体核酸检测适用的人群推荐如下。2.1门诊患儿(1)急性上呼吸道感染患儿,一般不常规进行呼吸道病原体的核酸检测,但对于有特异性抗病毒药物的病毒感染,如流感病毒,可视条件或在其他检测方法不能明确诊断时,使用核酸检测,有利于抗病毒药物的合理应用。(2)急性下呼吸道感染患儿,或有心肺等重要脏器的基础疾病、免疫功能异常的急性呼吸道感染患儿,建议根据患J阵龄、临床特征和发病季节等及时选用可疑病原的核酸检测方法进行病原学确定,尽
14、快明确病原体,有助于患儿治疗方案的确定和后续管理。2.2急诊及住院患儿(1)对有急诊适应证及所有因急性呼吸道感染性疾病住院、住院期间新出现呼吸道感染症状(伴或不伴发热X或出现不明原因的呼吸窘迫、慢性心肺疾病急性恶化、血液病、肿瘤患儿出现中性粒细胞减少/缺乏伴发热的,应根据年龄、临床特征和发病季节等,推荐选择核酸检测方法进行病原学诊断,为鉴别诊断需要可采用多重核酸检测。(2)有急性呼吸道感染的危重症患儿,建议首选多重核酸检测。若常规核酸检测不能明确病原,推荐采用mNGS进行病原学检测,但其结果需要结合临床表现综合分析,必要时使用其他方法进一步验证。3、呼吸道病原体核酸检测的标本类型及选择3.1适
15、宜标本类型(1)上呼吸道标本主要有鼻拭子(nasalswab,NS)、口咽拭子(OrOPharyngealswabs,OPS)、鼻咽拭子(nasopharyngealswab,NPS)、鼻咽吸取物(nasopharyngealaspirates,NPA)、鼻腔洗液(nasalwashing,NW)和咽洗液等。SARS-CoV-2感染流行以来,上呼吸道各种标本的组合也得到了验证,使用OPS和前鼻孔取样的配对采集被证明与NPS采集的效能相当。唾液和咽喉漱口水等非侵入性方法易于采集,并可用于大规模人群监测,也被广泛关注21(2)下呼吸道标本主要为痰、气管吸取物、支气管镜检查获得的标本,包括肺泡灌洗液
16、(bronchoalveolarlavagefluid,BALF)和保护性毛刷标本等。(3)血液、胸腔积液、组织或局灶穿刺物等标本也可应用病原体核酸扩增检测(nucleicacidamplificationtest,NAATX3.2不同病原体检测的标本类型选择根据使用试剂盒的要求选择合适的呼吸道感染病原体检测的标本类型,对于非试剂盒指定适宜的标本类型,事先应对试剂盒进行适用性评估。3.2.1病毒上、下呼吸道标本及血液、胸腔积液等标本均可用来行病毒NAATo3.2.2细菌(1)上呼吸道标本通常不推荐用于细菌NAATe但百日咳鲍特菌主要感染鼻咽部,因此NPS适宜用于百日咳NAAT22,有报道显示O
17、PS与NPS检测百日咳的敏感性一致23(2)诱导痰、气管吸取物和BALF等下呼吸道标本及无菌体液或组织标本是进行细菌NAAT的适宜标本24.3.2.3非典型病原体上、下呼吸道标本均适宜于肺炎支原体、肺炎衣原体和军团菌的NAAT,但下呼吸道标本的结果更具病原学诊断价值。3.2.4真菌怀疑下呼吸道真菌感染时,建议采集BALF、无菌体液或组织标本进行真菌NAAT;怀疑真菌性鼻窦炎时可酌情采集鼻窦分泌物和组织标本。各种标本采集及转运方法见表1,参照美国传染病学会美国微生物学会2018年更新的用于传染病诊断的微生物实验室使用指南修订,供临床医师参考24o4、呼吸道病原体核酸检测结果解读及注意事项4.1常
18、规核酸检测常规核酸检测是序列依赖的核酸检测,只能扩增特异性引物所覆盖的核酸序列。随着多重核酸检测方法越来越多的使用,同一份标本中可能会同时检测出多种病原体,提示存在混合感染。临床医师需要结合不同病原体的季节流行特征、生物学特性和致病特点,核酸检测结果提示的病原体相对载量高低,患儿临床特征等进行综合分析,以明确哪一种病原体是主要病原体。4.1.1核酸检测阳性上、下呼吸道标本的病原体核酸阳性结果在病毒、细菌、非典型病原体及真菌感染中的诊断价值有差别。若核酸检测阳性结果与临床表现严重不符,要注意是否有引物的特异性差和实验室污染等方面的问题,另外,痰液也有被上呼吸道病原污染的可能,临床医师需及时与实验
19、室方面沟通。4.1.1.1病毒急性期上或下呼吸道标本检测阳性,可提供病原学参考。由于部分病毒存在较高的无症状感染率,故上呼吸道标本的阳性结果要结合临床综合考虑,下呼吸道标本的病原学诊断价值更大。4.1.1.2细菌下呼吸道标本、血液等无菌体液标本核酸阳性检测结果具有诊断价值;百日咳鲍特菌主要感染鼻咽部,上呼吸道标本检测阳性具有诊断意义。4.1.13非典型病原体上、下呼吸道标本核酸检测阳性,多数情况下对肺炎支原体、肺炎衣原体和军团菌等非典型病原体具有诊断价值,但下呼吸道标本结果更具有病原学价值。4.1.1.4真菌下呼吸道标本、无菌体液、器官组织、鼻窦分泌物等标本真菌检测阳性结果,具有诊断价值。4.
20、1.2核酸检测阴性(1)结合患儿临床表现除外某种病原体感染。(2)若临床高度提示某种病原体感染,但核酸检测阴性,要考虑标本是否合格、病原体可能存在变异、试剂的检测阈值和质量以及实验室检测等方面的问题,临床医师要及时与实验室反馈和沟通。4.2mNGSmNGS的标准操作、数据分析、结果判读等尚无标准化流程,但随着mNGS技术在临床上的不断推广,国内临床和检验领域发布了一系列专家共识,对mNGS中存在的某些共性问题,尤其是结果报告和解读提出建议25-28LmNGS病原检测结果可向临床提供有效的线索,但存在一定的局限性,建议由具有一定生物信息学知识,并从事临床感染或临床微生物等专业人员,结合患儿临床背
21、景、影像学资料、其他实验室检查结果进行综合判断,避免盲目依据mNGS报告开展治疗,导致抗微生物药物的滥用2614.2.1报告内容(1)报告病原体列表:建议按照细菌、病毒、真菌和寄生虫等病原体类型以及临床关注程度分类呈现,便于快速锁定目标病原;病原体信息应准确到种信息,同时应包含相应的属信息。(2)建议至少列出但不限于如下报告参数:检出序列数(reads数)、基因组覆盖度、鉴定置信度、相对丰度等。reads数指的是测序获得的碱基序列的数量,检测报告中常列出某微生物种属名下的序列数,即匹配到该病原体的序列数目,其多少与标本中病原体本身载量、人源序列比例有关;基因组覆盖度是表示检测到的该微生物核酸序
22、列覆盖到该微生物整个基因序列的比值,覆盖度高表示该微生物全基因组测到的比率高;鉴定置信度是根据序列比对数、基因组大小和基因组保守性,判断样本中存在该微生物的可信度;相对丰度是指按照细菌、真菌、病毒和寄生虫进行分类,结合基因组大小,计算出该病原体在相应分类中的相对比例25-2604.2.2报告解读由于呼吸道中广泛存在定植微生物,为提高解读准确性,在mNGS检出序列数和覆盖度的基础上,应结合采集样本类型、采样位置、患儿的临床特征、基于传统技术检测的病原体和辅助检查报告,综合判断致病菌、定植菌和背景菌。报告解读中尤其需要重点关注以下几个方面。(1)样本质量:对结果正确的解读首先要建立在合格样本的基础
23、上。采集的样本应是感染部位的体液或组织,并严格执行样本采集的无菌流程。污染防控对样本结果的质量控制至关重要。(2)对照质控:每批次实验中均应设立内参照、阴性对照品和阳性对照品。阴性对照或内参用于提示流程是否存在异常,有助于判断样本结果的假阳性。(3)检出阈值:有研究认为,在mNGS的临床诊断应用中,检出阈值设定方法为,病毒的序列中有N3条不同基因组区域的非重叠reads,细菌、真菌和寄生虫reads数高于阴性对照的10倍及以上29I但在实践应用中,由于mNGS病原诊断的阈值影响因素较多,包括测序平台、测序流程、标本类型、病原种类、患JLU况等,目前尚无统一共识性或标准的检出阈值。(4)基于基因
24、序列数量的解读:根据测序原理,病原体的基因序列数越多,相对丰度越高,表示样本中检测到该病原体的可信度就越高。样本中某一种微生物检出的reads数越多,其为致病病原体的可能性越大。但不同病原微生物的基因组差异较大(寄生虫真菌细菌病毒),核酸提取效率存在差异,因此不能仅依靠reads数多少来判断是否感染,需同时考虑病原微生物种类差异与致病特性。对于在核酸提取过程中破壁困难的微生物,如分枝杆菌属、真菌等,即使在检测报告中reads数较低,也要考虑其为致病微生物的可能性,应采用其他方法开展验证,如特异引物的PCR、产物测序验证和血清学试验等。此外,如发现特殊罕见的病原体,即使其reads数很少,也应予
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