12 抗生素产生菌的菌种筛选及优化192.ppt

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1、第一章 抗生素产生菌的菌种及培养,1、抗生素与产生菌,半数以上抗生素由放线菌产生；真菌与细菌。放线菌抗生素两千多种，主要由链霉菌属产生。,真菌抗生素,真菌抗生素有数百种，主要是点青霉和产黄青霉产生的青霉素，荨麻青霉和灰黄青霉产生的灰黄霉素。灰黄霉素抗真菌（皮肤病与灰指甲病），对细菌无效。青霉素抗G+菌有效，对G-菌作用很弱，对人的副作用小，有过敏反应。,青霉素是一类群化合物，不同青霉素的侧链R各异。常用青霉素G，R为苯甲基。低浓度抑菌，高浓度杀菌。有的细菌产生青霉素酶，使酰胺环开裂而失去作用。苯甲基青霉素钠盐0.6g 为一个单位，1mg苯甲基青霉素钠盐等于1，667个单位。细菌抗生素多是多肽类

2、化合物。如短杆菌的短杆菌素S，枯草芽孢杆菌的枯草杆菌肽，多粘芽孢杆菌的多粘菌素等，对动物有毒性，只限外用。,抗生素产生菌的分离和筛选,目前新抗生素的获得途径：1、从自然界分离筛选新抗生素产生菌 从土壤到海洋 一般常见到极端微生物 从微生物到植物、海洋生物。2、改造现有的已知抗生素的产生菌，再经筛选获得新得抗生素产生菌。3、从已知的抗生素进行结构改造，经筛选获得新的半合成抗生素。,4、采用新的筛选方法 如：应用定向生物合成和突变生物合成的原理，以及培养超敏细菌以寻找微量的抗生素，选用新的肿瘤模型来筛选抗肿瘤的抗生素。,5、采用现代分子生物学技术产生新抗生素（1）基因克隆产生新抗生素：首先获得某已

3、知抗生素的结构基因，然后通过一定的载体将基因片段导入特定的另一种抗生素产生菌中，则可能产生完全符合人们设计要求的新抗生素。（2）沉默基因的激活：引入抗生素生物合成的调控基因，有可能激发抗生素产生菌处于休眠状态或沉默状态的基因系统，从而开启另一结构抗生素的生物合成开关，得到新抗生素。,绝大多数抗生素的原始产生菌是从自然界分离筛选获得，以传统的分离土壤放线菌为例，说明新抗生素产生菌的常规分离和筛选过程。,一、土壤微生物的分离1、采土 以春、秋两季采土为宜。去除表土，采取5-10cm深处的土壤，装入无菌容器。2、分离菌株 将2-4克土壤均匀散布水中待其沉降，上清部分经适当稀释后（一般为10-3-10

4、4），涂布于适宜培养基中，并培养至单菌落出现，挑取单个菌落移种纯培养，根据菌落的特征，初步排除相同菌。,二、筛选：是指从大量待筛选微生物中，尽快地鉴别出有实用价值的抗生素产生菌的实验过程。,1、筛选模型：是指筛选工作中所使用的实验菌。为了避免感染病原菌的危险，尽可能选用非致病的、且能代表某些类型致病菌的微生物作为实验菌。,常用的实验菌和代表的致病微生物,实验菌 代表的致病微生物 金黄色葡萄球菌 革兰阳性球菌 枯草芽孢杆菌 革兰阳性杆菌 耻垢分支杆菌 结核分枝杆菌 大肠埃希菌 革兰阴性杆菌 白假丝酵母菌 酵母状真菌 曲霉 丝状真菌 噬菌体 病毒、肿瘤细胞,2、筛选方法 抗菌抗生素一般采用琼脂扩散

5、法。,先制备含实验菌的平板，然后以无菌滤纸片蘸取各放线菌的摇瓶培养发酵液或切取一定大小的放线菌琼脂培养块，置于含菌平板上，培养后观察有无抑菌圈产生。,无分支单细胞微生物的群体生长曲线,1.迟缓期（1）主要特征：代谢活跃，大量合成细胞分裂所需的酶类、ATP等；体积增大；分裂迟缓。（2）原因：在新的环境，缺乏分解或催化相关底物的酶。（3）缩短和消除迟缓期的方法有：增加接种量、采用最适种龄、选用繁殖速度快的菌种以及尽量保持接种前后所处的培养基介质和条件一致。,2.对数期（1）特点：分裂速度最快、代时最短、代谢活动旺盛、对环境变化敏感。（2）作用：作为代谢、生理等研究的好材料和发酵生产中用作种子的最佳

6、菌龄。,3.稳定期（1）特点：新生的细胞和死亡的细胞数目相等、总菌数达到最大值、代谢活力钝化。（2）原因：营养物质的逐渐消耗以及代谢废物的积累抑制了生长。（3）功能：产生次生代谢产物（抗生素、生物碱、色素等）、芽孢；对稳定期的研究发展了连续培养技术。,4.死亡期 特点：活的细胞数目以对数速率急剧下降、细胞裂解或自溶。,1.微生物群体生长的规律,生长曲线代表在新的适应环境中生长、分裂直至衰老、死亡全过程的动态变化规律。分为迟缓期、对数期、稳定期和死亡期四个主要的时期。生长曲线的不同时期反映的是群体而不是单个细胞的生长规律。认识和掌握微生物的生长曲线有重要的实践意义。如设法缩短迟缓期、延长对数期以

7、及在稳定期收集菌体。,丝状微生物的群体生长1.特征：丝状生长和沉淀生长两种方式。2.丝状微生物生长以单位时间内微生物的物质量的变化来表示。,三、连续培养,（一）分批培养和连续培养1.概念：分批培养：指将微生物置于一定容积的培养基中，经过培养生长，最后一次收获的培养方式。连续培养：在一个恒定容积的流动系统中培养微生物，一方面以一定速率不断地加入新的培养基，另一方面又以相同的速率流出培养物(菌体和代谢产物)，以使培养系统中的细胞数量和营养状态保持稳定。,2.连续培养系统的类型,第三节 环境因素对微生物生长的影响,一、温度,温度太低：使原生质膜处于凝固状态，不能正常进行 营养物质的运输或形成质子梯度

8、。温度太高：蛋白质、核酸和细胞的其他组成发生不可 逆的变形作用。最低生长温度三种基本温度 最适生长温度 最高生长温度,根据生长温度分类：1.嗜冷微生物 2.嗜温微生物 3.嗜热微生物 4.嗜高热微生物,小结：,1.嗜冷微生物能够在低温条件下生长的原因是：其所含的酶在低温能有效地催化生化反应；在低温下主动运输仍能正常进行，有效的吸收必须的营养物质，是其原生质膜中含有较多的不饱和脂肪酸，在低温下仍可维持膜的流动性。2.嗜高温微生物在高温条件下生长的原因是：其酶和其他蛋白质在高温时更稳定；其蛋白质合成机构和细胞质膜（富含饱和脂肪酸等）等结构成分是热稳定。,3.微生物耐热性在实践中的重要性：发酵生产的

9、优点是发酵周期短，效率高；有利于非气体物质在发酵液中的扩散和溶解，以及防止杂菌的污染；可节约冷却发酵热量所需的成本。,二、pH,1.pH影响微生物生长的原因：介质pH影响生活环境中营养物质的可给态和有毒物质的毒性；影响菌体细胞膜的带电荷性质、膜的稳定性及膜对物质的吸收能力；使菌体表面蛋白变性或水解。2.分类：嗜酸性微生物（pH5.4）嗜中性微生物（pH5.4pH8.5）嗜碱性微生物（pH7.0 pH11.5）,3.嗜酸或嗜碱微生物耐酸或耐碱的原因：主要是由于细胞本身具有维持胞内pH值接近中性的能力。嗜酸微生物在酸性环境中，细脑膜可以阻止H进入胞内、不断将胞内H排出胞外。而嗜碱或耐碱微生物，则可

10、以阻止OH进人胞内并将其排出胞外，以维持胞内接近中性pH。,生产中常用菌种的分离、选育和保藏,带图象分析系统的微生物菌种显微观察装置,一、菌种的来源,根据资料直接向有科研单位、高等院校、工厂或菌种保藏部门索取或购买；从大自然中分离筛选新的微生物菌种。,二、分离思路,新菌种的分离是要从混杂的各类微生物中依照生产的要求、菌种的特性，采用各种筛选方法，快速、准确地把所需要的菌种挑选出来。实验室或生产用菌种若不慎污染了杂菌，也必须重新进行分离纯化。有了优良的菌种，还要有合适的工艺条件和合理先进的设备与之配合。,定方案：首先要查阅资料，了解所需菌种的生长培养特性。采样：有针对性地采集样品。增殖：人为地通

11、过控制养分或培条件，使所需菌种增殖培养后，在数量上占优势。分离：利用分离技术得到纯种。发酵性能测定：进行生产性能测定。这些特性包括形态、培养特征、营养要求、生理生化特性、发酵周期、产品品种和产量、耐受最高温度、生长和发酵最适温度、最适pH值、提取工艺等。,三、新种分离与筛选的步骤,（一）采样,1、采样对象 以采集土壤为主。一般园田土和耕作过的沼泽土中，以细菌和放线菌为主，富含碳水化合物的土壤和沼泽地中，酵母和霉菌较多，如一些野果生长区和果园内。采样的对象也可以是植物，腐败物品，某些水域等。,从自然界筛选,2、采样季节：以温度适中，雨量不多的秋初为好。3、采土方式：在选好适当地点后，用小萨子除去

12、表土，取离地面5-15cm处的土约10g，盛入清洁的牛皮纸袋或塑料袋中，扎好，标记，记录采样时间、地点、环境条件等，以备查考。为了使土样中微生物的数量和类型尽少变化，宜将样品逐步分批寄回，以便及时分离。,培养基的组成原则,大多数放线菌的分离培养是在贫脊或复杂底物的琼脂平板上进行的。除嗜温性放线菌外，其他放线菌一般在培养4-20天内在分离平板上缓慢形成菌落。在放线菌分离琼脂中通常都加入抗真菌剂制霉菌素或放线菌酮，以抑制真菌的繁殖。选择性地添加抗生素。分离琼脂平板制备好后，一般皆应在37培养箱中存放3天。,放线菌的分离,土样中放线菌的非选择性分离：土样风干，磨碎，无菌海绵压印土样后压印平板后培养。

13、植物体上放线菌的分离：无菌取植物组织，干燥以减少细菌数量，剪碎植物材料后植入平板表层后培养。也可洗下微生物后振荡培养。水中放线菌的分离：为使所要分离的放线菌的数量种类增多，一般将水样离心或滤纸过滤，取离心沉积或滤纸表面沉积进行系列稀释和涂布。,次代培养及纯化,菌落形成后可根据肉眼可见的菌落形态上的差异，作初步的鉴定和区分。通过高倍放大进行镜检，可了解气生和营养孢子形成情况。成功地分离出各种不同的放线菌属及种的关键是所采集样本的本身及其分离用的琼脂培养基；而肉眼识别不同的生长形态、从而初步地加以鉴定，在分离放线菌时显得尤为重要。将分离平板上所形成的菌落用经火焰灼烧灭菌的钩形针或无菌牙签挑取，点接

14、到琼脂平板上进行影印培养，以进一步筛选和分离。,工业菌种的育种方针,工业菌种的育种：是运用遗传学原理和技术对某个用于特定生物技术目的的菌株进行的多方位的改造。通过改造，可使现存的优良性状强化，或去除不良性质或增加新的性状。,工业菌种育种的方法,诱变基因转移基因重组,育种过程,包括下列3个步骤：(1)在不影响菌种活力的前提下，有益基因型的引入。(2)希望基因型的选出。(3)改良菌种的评价(包括实验规模和工业生产规模)。,选择育种方法时综合考虑的因素,(1)待改良性状的本质及与发酵工艺的关系(如批式或连续发酵试验)；(2)对这一特定菌种的遗传和生物化学万面认识的明了程度；(3)经济费用。如果对特定

15、菌种的基本性状及其工艺知晓甚少，则多半采用随机诱变、筛选及选育等技术：如果对其遗传及生物化学方面的性状已有较深的认识，则可选择基因重组等手段进行定向育种。,工业菌种改良方法,(1)解除或绕过代谢途径中的限速步骤：通过增加特定基因的拷贝数或增加相应基因的表达能力来提高限速酶的含量；在代谢裔途径中引伸出新的代谢步骤，由此提供一个旁路代谢途径。(2)增加前体物的浓度。(3)改变代谢途径，减少无用副产品的生成以及提高菌种对高浓度的有潜在毒性的底物、前体或产品的耐受力。,(4)抑制或消除产品分解酶。(5)改进菌种外泌产品的能力。(6)消除代谢产品的反馈抑制。如诱导代谢产品的结构类似物抗性。,提高特定基因

16、的表达水平,(1)引入强转录及翻译信号，可通过在一高效表达载体上克隆靶基因；在靶基因的上游引入强启动子；修改现有表达信号，提高基因效力等。(2)诱导解除基因表达抑制的突变。,改进菌种的生长效率,提高菌株对底物的利用率方法：a.通过确定并改变代谢中的耗能部分;b.由另一菌株的高效低能代谢途径代谢来实现。c.赋予菌种对多种底物，特别是价廉而丰富的底物的利用能力，由此可降低操作费用。,诱变育种,以微生物的自然变异作为基础的生产选种的机率并不很高，一个基因的自然突变频率仅10-6-10-10左右。诱变育种：以诱发突变为基础的育种，是迄今为止国内外提高菌种产量、性能的主要手段。,诱变,物理、化学或生物诱

17、变方法,一、诱变剂和诱变处理,物理诱变剂：射线如紫外线、X射线、射线，快中子；物理因素中目前使用得最方便而且十分有效的是紫外线。许多高产菌株的选育都用过紫外线，对于一般实验室、中小型工厂都适用，也很安全。其他的几种射线都是电离性质的，有一定的穿透力，一般都由专业人员在专门的设备中使用，否则有一定危险性。,化学诱变剂：化学因子如碱基类似物、5氟尿嘧啶、烷化剂等。化学诱变剂中使用最多、最有效的是烷化剂。使用化学诱变剂的优缺点：1、大多数情况下，就突变数量而言，要比电离辐射更有效。,2、化学诱变剂是很经济的，因为只需要少量的合适的诱变剂，设备是实验室的一般玻璃器皿，一个蒸气罩。而用电离辐射行工作时，

18、设备费用大，并要注意安全性。3、大部分诱变剂是致癌剂，所以在使用中必须非常谨慎，要避免化学诱变剂与皮肤接触，且切勿吸入其蒸气，有人对某些诱变剂极其敏感，甚至未直接接触就会过敏，这就更要当心。,诱变剂的选择,1碱基类似物和羟胺具有很高的特异性，但很少使用，回复突变率高，效果不大。2亚硝酸和烷化剂应用的范围较广，造成的遗传损伤较多。其中亚硝基胍和甲基磺酸乙酯常被称为“超诱变剂”，甲基磺酸乙酯是毒性最小的诱变剂之一。,3吖啶类诱变剂可以造成生化代谢途径的完全中断。4紫外线仍十分有效。电离辐射是造成染色体巨大损伤的最好诱变剂，它能造成不可回复的缺突变。但它可能影响邻近基因的性能。,二、诱变育种步骤,出

19、发菌株的选择处理菌悬液的制备诱变处理中间培养分离和筛选,(一)出发菌株的选择,1自然界新分离的野生型菌株，对诱变处理较敏感，容易达到好的效果。2在生产中经生产选种得到的菌株与野生型较相像，也是良好的出发菌株。3每次诱变处理都有一定提高的菌株，往往多次诱变能积累较多的提高。4出发菌株开始时可以同时选23株，在处理比较后，将更适合的出发菌株留作继续诱变。,5要尽量选择单倍体细胞、单核或核少的多细胞体来作出发诱变细胞，这是由于变异性状大部分是隐性的，特别是高产基因。6根据采用的诱变剂或根据细胞生理状态或诱变谱选择诱变剂，因为同一诱变剂的重复处理会使细胞产生抗性，使诱变效果下降。有的诱变剂是作用于营养

20、细胞，就要选对数期的细胞：有的作用于休止期，就可选用孢子。,(二)处理菌悬液的制备,这一步骤的关键是制备单细胞和单孢子状态的、活力类似的菌悬液，为此要进行合适培养基的培养，并要离心，洗涤，过滤。,(三)诱变处理,根据前面有关诱变剂及诱变处理的介绍，结合诱变对象的实际，设计诱变处理方案。,(四)中间培养,由于在发生了突变尚未表现出来之前，有一个表现延迟的过程，即细胞内原有酶量的稀释过程(生理延迟)，需3代以上的繁殖才能将突变性状表现出来。这个过程对今后的筛选和获得稳定菌株都是极为重要的。,方法：让变异处理后细胞在液体培养基中培养几小时，以让细胞的遗传物质复制，让细胞繁殖几代，以得到纯的变异细胞。

21、这样，隐性的变异就会显现出来，若不经液体培养基的中间培养，直接在平皿上分离就会出现变异和不变异细胞同时存在于一个菌落内的可能，形成混杂菌落，以致造成筛选结果的不稳定和将来的菌株退化。,(五)分离和筛选,筛选分初筛和复筛。初筛以迅速筛出大量的达到初步要求的分离菌落为目的，以量为主。复筛则是精选，以质为主，也就是以精确度为主。因此在具体方法上就有差异.例如初筛可以在平皿上直接以菌落的代谢产物与某些染料或基质的作用形成的变色圈或透明圈的大小来挑取参加复筛者，而将90%的菌落淘汰。在数量减少后就要仔细比较参加复筛和再复筛的菌株，最后才能选得优秀菌株。在以后的复筛阶段，还应不断结合自然分离，纯化菌株。,

22、紫外线的诱变育种,紫外线诱变一般采用15W紫外线杀菌灯，波长为2537A灯与处理物的距离为1530cm，照射时间依菌种而异，一般为几秒至几十分钟。一般我们常以细胞的死亡率表示，希望照射的剂量死亡率控制在7080%为宜。,被照射的菌悬液细胞数，细菌为106个ml左右，霉菌孢子和酵母细胞为106107个ml。由于紫外线穿透力不强，要求照射液不要太深，约0.51.0cm厚，同时要用电磁搅拌器或手工进行搅拌，使照射均匀。由于紫外线照射后有光复活效应，所以照射时和照射后的处理应在红灯下进行。,(二)操作步骤 1将细菌培养液以3000rmin离心5min，倾去上清液，将菌体打散加入无菌生理盐水再离心洗涤。

23、2将菌悬液放入一巳灭菌的，装有玻璃珠的三角瓶内用手摇动，以打散菌体。将菌液倒入有定性滤纸的漏斗内过滤，单细胞滤液装入试管内，一般处于浑浊态的细胞液含细胞数可达108个ml左右，作为待处理菌悬液。,3取24m1制备的菌液加到直径9cm培养皿内，放入一无菌磁力搅拌子，然后置磁力搅拌器上、15W紫外线下30cm处。在正式照射前，应先开紫外线10min，让紫外灯预热，然后开启皿盖正式在搅拌下照射1050s。操作均应在红灯下进行，或用黑纸包住，避免白炽光。,4取未照射的制备菌液和照射菌液各o.5ml进行稀释分离，计数活菌细胞数。5取照射菌液2ml于液体培养基中(300ml三角瓶内装30ml培养液)，12

24、0rmin振荡培养46h。6取中间培养液稀释分离、培养。7挑取菌落进行筛选。,亚硝基胍诱变曲霉菌,N甲基N-硝基-N-亚硝基胍(NGN，MNNG或TG)对真核或原核微生物都有强烈的诱变作用。其精确的作用机制尚不很清楚，据认为是伴随着重氮甲烷的生成及在酸性条件下生成亚硝酸，直接作用于细胞内的DNA复制系统，从而诱发了变异。MNNG的诱变作用随pH的升高而增强。,(二)操作步骤 1单孢子悬液制备 取斜面，加入6ml 0.1molL pH6.o的磷酸缓冲液，用接种环刮下孢子，振荡试管，立即通过带滤纸漏斗过滤，由此制得单孢子悬液，若孢子液浑浊状，其孢子浓度可达l06个ml，此为待处理孢子悬液。2MNN

25、G溶液的制备 用分析天平称取2mg，加入2ml 0.1molL pH 6.0磷酸缓冲液，于暗处振荡溶解。,3诱变处理 吸取MNNG溶液lml，加入到1m1孢子悬液中，30振荡30min，立即稀释1000倍停止作用，然后以10-2，10-4两个稀释度分离培养，30 3天后计数。4死亡率计算 将未处理的孢子液1ml加入1ml磷酸缓冲液中，同上逐级稀释分离，30下培养3天。根据处理前后的活孢子数可计算出死亡率。5挑取菌落进行糖化酶及蛋白酶产量筛选,第五节 营养缺陷型的选育,营养缺陷型是指通过诱变而产生的缺乏合成某些营养物质如氨基酸、维生素和碱基等的能力，必须在其基本培养基中加入相应的营养成分才能正常

26、生长的变异株。与营养缺陷型对应的是野生型。,能满足野生型菌株正常生长的培养基称基本培养基(MM)；在基本培养基中加入相应的营养成分的称补充培养基(SM)；能满足各种营养缺陷型生长的称完全培养基(CM)，如牛肉膏蛋白胨培养基、麦芽汁培养基等。,营养缺陷型的用途,营养缺陷型在生产上和科学研究上用途很大。目前生产氨基酸、核苷酸的菌种都是各种类型的缺陷型。要研究代谢途径，育种技术都必须有营养缺陷型的菌株为材料。,筛选营养缺陷型的步骤,诱变淘汰野生型检出缺陷型确定生长谱,一、诱变方法,物理诱变化学诱变,二、淘汰野生型,抗生素法：野生型能在MM中生长，而缺陷型不能，于是将诱变处理液在MM中培养短时让野生型

27、生长，处于活化阶段，而缺陷型无法生长，仍处于休眠状态。由于细菌或酵母对一些抗生素敏感，于是就相应加入一定量的抗生素，结果活化状态的野生型就被杀死，保存了缺陷型。一般细菌可以采用青霉素，酵母可采用制霉菌素。菌丝过滤法：对于霉菌，因孢子生长后会长出菌丝体，就可用滤纸过滤法将菌丝滤去，而缺陷型孢子却因未发芽而不能滤过。,三、检出缺陷型,原理：在固体基本培养基和完全培养基上，生长情况完全不同，缺陷型在CM上生长良好，而在MM上则不生长，野生型都能生长。具体方法：影印法、点种法、夹层法,1将一较平皿直径小1cm的金属圆筒蒙上一层灭菌的丝绒，用金属夹夹住，灭菌。2将完全培养基上长出的全部菌落在丝绒上轻轻一

28、压，使之成为印模，标记方位。3将基本培养基平皿和完全培养基平皿在标记的同一方位上先后轻轻一压，此菌印模即复印于上。,(一)影印法,4 将CM和MM在恒温箱中培养。5二平皿相同方位进行比较，即可发现在MM平皿上长出的菌落少于GM平板上的。MM上未长而相应于CM上长出的那几个菌落就可能是缺陷型。此法要求平皿上菌落不能太多，菌落之间应有一定间隔。,(二)点种法,也就是任意法。用接种针或牙签将CM上长出的菌落在MM和CM两副平板上接种，依次在相应位置点种，然后一起培养，观察其生长情况。此法结果明确，但工作量大。,(三)夹层法,先在培养皿上倒一层基本琼脂培养基，凝固后涂上一层含菌的MM，凝固后再倒一薄层

29、MM琼脂培养基，培养24h，将出现的菌落标记，然后倒上一层CM琼脂培养基，再培养。这时第二批长出的菌落就可能是缺陷型。此法缺点是，结果有时不明确，而且将缺陷型菌落从夹层中挑出并不很容易。,四、营养缺陷型生长谱的确定,验证确定是缺陷型后，就需确定其缺陷的因子，即生长谱测定。,生长谱测定的方法,将缺陷型菌株培养后，收集菌体，制备成细胞悬液，与MM培养基(融化并凉至50)混合并倾注平皿。待凝固后，分别在平皿的56个区间放上不同的营养组合的混合物或吸饱此组合营养物的滤纸圆片。培养后会在某组合区长出，就可测得所需营养。个平皿测一个菌。,以不同组合的营养混合物与融化凉至50的MM培养基混合铺成平皿，然后在

30、这些平皿上划线接种各个缺陷型菌株于各相应位置，培养后根据在这些组合长出可推知其营养因子。在56个平皿上可测20株菌以上。,第六节 基因育种,基因重组育种：是运用体外DNA各种操作或修改手法获得目的基因，再借助于病毒、细菌质粒或其他载体，将目的基因转移至新的宿主细胞并使其在新的宿主细胞系统内进行复制和表达，或者通过细胞间的相互作用，使一个细胞的优秀性状经其间遗传物质的交换而转移给另个细胞的方法。,一个完整的基因克隆过程包括以下步骤,、获得待克隆的DNA片段（基因）；、目的基因与载体在体外连接；、重组DNA分子导入宿主细胞；、筛选、鉴定阳性重组子；、重组子的扩增与或表达。,2.2基因重组,一、质粒

31、的特点,1、质粒的存在并非微生物生命活动必需。2、每个细胞中存在的质粒数称为该质粒的拷贝数。不同类型的质粒其拷贝数各异，同一质粒在不同条件下，拷贝数也可能差异很大，有严紧型和松弛型两种。3、质粒DNA分子常呈现三种形态；常见的一种是共价、闭环状DNA(CCC DNA)；其次是由于条链有缺口而产生的开环DNA(ocDNA)；第三种是由双环分子两段均断裂而产生的线性DNA。,质粒载体,二、各类质粒所赋予宿主细胞的不同表现型,抗生素抗性：抗生素的产生；大肠杆菌素的产生；肠毒素的产生；复杂有机化合物的降解；限制性核酸内切酶和修饰酶的产生；杀伤性能。在自然条件下，许多质粒可经细菌接合或相似方式在宿主间相

32、互转移。在实验室条件下，质粒也可经人工手段将其转化入宿主细胞内。,三、质粒DNA的提取方法,细菌培养和质粒扩增；细菌的收获和裂解；质粒DNA的提取。,四、遗传转化,转化是指受体细胞直接摄取供体细胞游离的DNA片段，将其同源部分进行碱基配对，组合到自己的基因中，从而获得供体细胞的某些遗传性状。,(二)操作步骤：质粒DNA转化感受态大肠杆菌1从琼脂平板上挑取新鲜菌落接入10ml肉汤培养基中，37培养过夜。2取0.5ml培养物接入50ml肉汤中，无菌添加0.4ml 2.5molLMgCl2，于37振荡培养。3将o.1molL CaCl2溶液、试管及吸管在冰浴中冷却。,4当培养物OD600在o.5o.

33、8左右时，开始收获细胞(大约需22.5h)5将培养物置冰浴中冷却10min。6取10ml培养物置2个冷离心管中弃去上清液。,7加入1ml 0.1molL CaCl2，再加0.9ml CaCl2，置冰浴中放置20min。83000rmin离心10min，弃去上清液9加入1ml 0.1molL CaCl2，重新悬浮细胞，置冰浴中保存。10加入120l待转化质粒 DNA溶液。,11在冰上放置20min，在37处理2min。再插入冰中加入0.9m1肉汤37静置培养90min。12以不同的量涂布选择培养基平板。13于37培养过夜。鉴定转化菌落。,常用的遗传转化系统,1、自然系统2、人工诱导（完整细胞）（

34、1）二价阳离子系统：Ca2+，Ca2+Mg2+，Mg2+，Ca2+辅助噬菌体，Tris+Ca 2+（2）单价阳离子系统：PEG+Li+/Cs+/Rb+（3）冻融系统（4）Triton处理：人工诱导（PEG/原生质体）,重组DNA中常用的工具酶,包括限制性核酸内切酶、DNA连接酶、DNA聚合酶、逆转录酶等.,限制性内切酶,切开DNA分子所需的酶：每一种酶都有其各自的作用位点。常用限制性内切酶种类及特性,W.Arber,H.O.Smith,限制性内切酶的剪切方式,粘性未端：切开后的两段DNA各留下一个尾，这2个尾的核苷酸顺序完全一样，中是方向相反。它们之间是互补的，在适当条件下可以再连接一起。,其

35、它工具酶,连接酶T4 DNA修补工具酶DNA聚合酶I末端加工酶S1核酸酶，碱性磷酸单脂酶末端转移酶人工加polyA 或polyT 尾反转录酶,载体宿主系统,载体(vector)是携带外源DNA进入宿主细胞进行扩增和表达的DNA；一般是通过改造质粒、噬菌体或病毒等构建的。,载体应具备以下条件：,、能在适当的宿主细胞中复制；、具有多种限制酶的单一切点（即所谓多克隆位点）以便外源DNA插入；、具有筛选标志以区别阳性与阴性重组分子；、载体分子较小，以便体外基因操作，同时载体DNA与宿主DNA便于分离；、对于表达型载体还应具有与宿主细胞相适应的启动子、增强子、加尾信号等基因表达元件。,宿主细胞必须符合以

36、下条件,、对载体的复制和扩增没有严格的限制；、不存在特异的内切酶体系降解外源DNA；、在重组DNA增殖过程中，不会对它进行修饰；、重组缺陷型，不会产生体内重组；、容易导入重组DNA分子；、符合重组DNA操作的安全标准。,目的基因的获取,一、通过建立基因文库分离靶基因基因文库包括两类：基因组文库：利用限制性内切酶。cDNA：用mRNA反转录成单链DNA，再经DNA聚合酶的作用产生双链DNA。可去除真核生物基因中不表达的内含子。,二、化学合成法制备DNA片段从蛋白质肽链的氨基酸顺序可以知道它的遗传密码，再依照密码合成基因。三、聚合酶链反应法扩增基因片段对于已知全部或部分核苷酸序列的基因，可以通过聚

37、合酶链反应（），以基因组DNA或cDNA模板扩增得到目的基因片段。,PCR技术,根据需扩增片段的两端设计引物。使DNA解链（高温），引物结合于基因的两端（低温），在合适温度下开始合成（链延长）反应。特点：需要很少的DNA模板，且能直接从基因组中得到目的基因。,DNA扩增,PCR反应,DNA片断的克隆,载体的条件：,a 复制起点 b 适宜的限制酶切点c 选择标记,DNA分子的体外连接 DNA片段的体外连接是重组DNA技术的关键。DNA连接是由DNA连接酶催化完成的。,一、DNA连接酶,DNA连接酶催化两条双链DNA片段相邻的5-磷酸和3-羟基间形成磷酸二酯键。在分子克隆中最有用的的DNA连接酶是

38、来自噬菌体的DNA 连接酶。T4 DNA连接酶在分子克隆中主要用于：、连接具有同源互补粘性末端的片段；、连接双链DNA分子间的平端；、在双链平端的DNA分子上添加合成的人工接头或适配子。,重组DNA导入宿主菌,体外连接的重组DNA分子必须导入适当的受体细胞中才能大量的复制、增殖和表达。根据所采用的载体的性质，将重组DNA分子导入受体可有不同的方法。,一、转 化,指以细菌质粒为载体，将外源基因导入受体细胞的过程。转化时，细菌必须经过适当的处理使之处于感受态即容易接受外源DNA的状态，然后利用短暂热休克使DNA导入细菌宿主中。此外还可用电穿孔法转化细菌，它的优点是操作简便、转化效率高、适用于任何菌

39、株。,二、转染和感染,利用噬菌体DNA作为载体时可经两种方式导入受体菌。一种是感染，即在体外将噬菌体DNA包装成病毒颗粒，然后使其感染受体菌。另一种方式是转染，即在DNA连接酶作用下使噬菌体DNA环化，再象重组质粒一样地转化进受体菌。但习惯上常把以噬菌体DNA为载体构建成的重组子导入细胞的过程统称为转染。,重组克隆的筛选与鉴定,基因克隆的最后一步是从转化细菌菌落中筛选出含有阳性重组子的菌落，并鉴定重组子的正确性。通过细菌培养以及重组子的扩增，获得所需的基因片段的大量拷贝。进一步研究该基因的结构、功能，或表达该基因的产物。,一、抗药性标志的筛选,如果克隆载体带有某种抗药性标志基因如ampr或te

40、trr，转化后只有含这种抗药基因的转化子细菌才能在含该抗菌素的平板上幸存并形成菌落，这样就可将转化菌与非转化菌区别开来。如果重组DNA时将外源基因插入标志基因内，该标志基因失活，通过有无抗菌素培养基对比培养，还可区分单纯载体或重组载体（含外源基因）的转化菌落。,二、半乳糖苷酶系统筛选,很多载体都携带一段细菌的lacZ基因，它编码半乳糖苷酶N-端的146个氨基酸，称为肽，它表达半乳糖苷酶的C-端肽链。当载体与宿主细胞同时表达两个片段时，宿主细胞才有半乳糖苷酶活性，使特异的底物X-gal 变为兰色化合物，这就是所谓的互补。而重组子由于基因插入使肽基因失活，不能形成互补，在含X-gal的平板上，含阳

41、性重组子的细菌为无色菌落或噬菌斑。,三、菌落快速裂解鉴定法从平板上直接挑选菌落裂解后，直接电泳检测载体质粒大小，判断有无插入片段存在，该法适于插入片段较大的重组子初筛。四、内切酶图谱鉴定经初筛鉴定有重组子的菌落，小量培养后，再分离出重组质粒或重组噬菌体DNA，用相应的内切酶切割，释放出插入片断；对于可能存在双向插入的重组子，还要用内切酶消化鉴定插入的方向。,重组DNA的鉴定,遗传学方法,第七节 杂交育种,(一)细菌杂交,在细菌中实现杂交的种类尚不多，主要是大肠杆菌，其他还有鼠伤寒沙门氏菌、铜绿假单胞菌、淋病奈氏球菌等。大肠杆菌中存着致育因子F，有F因子为F+，没有F因子称F-。F因子存在于细胞

42、中形式：游离状态(F+细胞)；整合状态，即F因子插入胞核质的一定位置上(Hfr细胞)。F因子有明显的感染性，大肠杆菌的接合，实质上是F因子的转移，所以F+和Hfr称供体菌，而F-称受体菌。,（二）酵母杂交育种技术,1、酵母繁殖方式 酵母为单细胞型真菌，一般以出芽方式生殖，在通常情况下，繁殖体为双倍体，但经过特定条件的诱导，可使其产生单倍体孢子并可出芽产生单倍体繁殖体。,单倍体细胞具及2两种交配型。两种交配型细胞经其细胞壁上特定的凝聚因子诱导而进行交配，恢复为双倍体；同一交配型细胞之间，则因细胞壁上凝集因子的存在而不能进行交配。在生活过程中，酵母细胞还可以形成三倍体、四倍体、多倍体或非整倍体细胞

43、。,2、酵母杂交 一般而言，杂交育种运用了酵母的单双倍生活周期，将不同基因型和相对的交配型的单倍体细胞经诱导杂交而形成二倍体细胞，经筛选便可获得新的遗传性状。酵母的杂交方法有孢子杂交法、群体交配法、单倍体细胞杂交法和罕见交配法。就啤酒酵母而言，运用罕见交配法更易获得结果。,第八节 原生质体育种,原生质体育种技术主要有原生质体融合、原生质体转化技术，此外尚有原生质体诱变育种等。原生质休融合育种是基因重组的一种重要方法。原生质体融合作为一种新的基因重组手段是1978年第三届国际工业微生物遗传学讨论会上提出来的。,一、原生质体融合育种的特点,(一)杂交频率较高：细胞壁去除后在高渗条件下形成类似于球形

44、的原生质体。(二)受接合型或致育型的限制较小：二亲株中任何一株都可能起受体或供体的作用，因此有利于不同种属间微生物的杂交。(三)遗传物质传递更为完整：原生质体融合是二亲株的细胞质和细胞核进行类似的合二为一的过程。,(四)存在着两株以上亲株同时参与融合形成融合子的可能性。（五有可能采用产量性状较高的菌株作融合亲株。(六)提高菌株产量的潜力较大。(七)有助于建立工业微生物转化体系。,二、原生质体融合育种步骤,1标记菌株的筛选和稳定性验证。2原生质体制备。3等量原生质体加聚乙二醇促进融合。4涂布于再生培养基，再生出菌落。5选择性培养基上划线生长，分离验证，挑取融合子进一步试验、保藏。6生产性能筛选。

45、,三、原生质体融合育种的要点,（一）标记菌种的选择 获得标记菌种的方法是采用常规诱变育种，筛选出营养缺陷型或和抗药性菌株。这里最重要的是标记必须稳定。采用抗药性菌株除可作标记外，在实验室中还可排除杂菌污染的干扰。为的是确证融合的成功，可以采用多标记菌种。,(二)原生质体的制备,原生质体的制备主要是在高渗压溶液中加入细胞壁分解酶，将细胞壁分离剥离，结果剩下由原生质膜包住的类似球状的细胞，它保持原细胞的一切活性。在放线菌和细菌中，制备原生质体主要采用溶菌酶；酵母和霉菌一般可用蜗牛酶或纤维素酶等。,影响原生质体制备的因素,1菌体的前处理 为了使酶作用的效果好一些，可将菌作一些前处理。如细菌加入亚抑制

46、剂量的青霉素。2菌体的培养时间 为了使细胞易于原生质体化，一般选择增殖期的菌体。3 酶浓度 对于不同种属的微生物，不仅对酶的种类要求不同，就是对酶的浓度也有差异。另外，最佳酶浓度还随不同的生长期的菌体而变化。,4酶处理温度 5破壁时的pH值6渗透压稳定剂 等渗透压在原生质体制备中，不仅起到保护原生质体免于膨裂，而且还有助于酶和底物的结合，渗透压稳定剂多采用甘露醇，山梨醇，蔗糖等有机物和KCl和NaCl等无机物。,第九节 筛选新的代谢产物,一、开发新的代谢产物的途径,(1)从自然界分离新的微生物菌株，或采用新的检阅方法筛选新的代谢产物。(2)对已知微生物的代谢产物进行化学修饰。(3)利用微生物转

47、化改造代谢产物的结构。(4)通过原生质体融合获得新的代谢产物。(5)DNA重组技术。,二、筛选微生物新的代谢产物的程序,突变型菌株的筛选,一、产量性状突变株的筛选,三、筛选微生物代谢产物的目标,筛选克服抗生素抗性菌株的活性物质；筛选抗肿瘤、抗病毒的活性物质；研究有药理活性的酶抑制剂及免疫调节剂；寻找食品工业最好的酵母培养物；筛选降解有害物质的微生物以及治疗上具有低毒、长效的化学药物等。,四、筛选微生物代谢产物的方法,(一)直接方法为了尽快确定微生物代谢产物的利用前途，在体外试验测得活性后，可以将培养液的有效成分直接作用于机体，观察被测样品的疗效。这种直接确定代谢产物用途的方法亦称动物体内治疗试

48、验。,(二)间接方法 筛选医用抗生素，可用细茵、真菌、病毒或肿瘤模型，寻找抗细菌、抗真菌、抗病毒、抗肿瘤抗生素、酶抑制剂、免疫制剂等有效物质。在预筛选时，多用琼脂平扳扩散抑菌法。通过预筛选，直接测定最初分离物的生物活性，能加速筛选过程。,五、检测系统,筛选过程的成功依赖于排除那些已知的或并非需要的代谢产物的检验方法，这样才能识别出人们需要的化合物。,性能签别,性能鉴别是分离和筛选微生物代谢产物中最基础的工作。鉴别可分为两方面：一是对微生物方面进行形态、培养、生化功能答试验观察，并确定微生物产生菌的类群；,二是从化学的早期鉴别来鉴别微生物的代谢产物。化学的早期鉴别一般对产生菌所产生的代谢产物进行

49、纸上层析、薄板层析、纸上电泳、抗茵谱、高压电泳、紫外分光光度法、液相和气相色谱等试验，井获得各种图谱，与已知图谱进行比较鉴别。,如果认为是有实用前途的代谢产物，则要进一步大量培养，并进行动物试验、毒性考查、药物代谢等实验，并进行提高发酵水平和改善提取工艺的工作，以备投入生产。如果是新的代谢产物一般要进一步确定其化学结构，井在此基础上进行合成法的研究或进行化学改造，研究结构与生物活性的相互关系，并对作用机制、生物合成过程作进一步的研究。,菌种筛选方法,诱变处理后，突变细胞只占存活细胞的百分之几，而能使生产状况提高的细胞又只是突变细胞中的少数。为了花费最少的工作量，在最短的时间内取得最大的筛选成效

50、，就要求采用效率较高的科学筛选方案和手段。,菌种筛选方案,初筛：目的是删去明确不符合要求的大部分菌株，把生产性状类似的菌株尽量保留下来，使优良菌种不致于漏网。初筛工作以量为主，测定的精确性还在其次。初筛的手段应尽可能快速、简单。复筛的目的是确认符合生产要求的菌株，所以，复筛步骤以质为主，应精确测定每个菌株的生产指标。,菌种筛选的手段,初筛从菌体形态变异分析 平皿快速检测法具体的有纸片培养显色法、变色圈法、透明圈法、生长圈法和抑制圈法等 摇瓶培养法摇瓶培养法也可用于初筛。初筛的摇瓶培养一般是一个菌株只做一次发酵测定，从大量菌株中选出10-20%较好的菌株，淘汰80-90%的菌株；而复筛中摇瓶培养