第3章 多肽与蛋白质类药物.ppt.ppt

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1、Chapter 3 多肽与蛋白质类药物,1953年人工合成了第一个有生物活性的多肽催产素以后，20世纪50年代都集中于脑垂体所分泌的各种多肽激素的研究。60年代，研究的重点转移到控制脑垂体激素分泌的各种多肽激素的研究。70年代，神经肽的研究进入高潮。生物胚层的发育渊源关系表明，很多脑活性肽也存在于肠胃组织中，从而推动了肠胃激素研究的进展。,3.1 多肽和蛋白质药物基本知识,基本概念多肽类药物是以多肽激素和多肽细胞生长因子为主的一大类内源性活性成分。蛋白质药物包括蛋白质类激素、蛋白质细胞生长调节因子、血浆蛋白质类、黏蛋白、胶原蛋白、蛋白酶抑制剂等，其作用方式从对机体各系统和细胞生长的调节，扩展到

2、被动免疫、替代疗法和抗凝血等。,细胞生长调节因子在体内和体外对效应细胞的生长、增殖和分化起调控作用的一类物质。许多生长因子在靶细胞上有特异性受体，仅微量就有较强的生理活性。,3.1 多肽和蛋白质药物基本知识,生物技术在该类中的应用,基因工程技术制造-胰岛素、干扰素、白介素、生长素、EPO等实现了工业化，发展方向为转基因动植物许多活性蛋白质、多肽都是由无活性的蛋白质前体，经过酶的加工剪切转化而来的有共同的来源，相似的结构，保留着若干彼此所特有的生物活性。研究活性多肽结构与功能的关系及活性多肽之间结构的异同与其活性的关系，将有助于设计和研制新的活性多肽药物。对蛋白质类药物进行结构修饰,按来源分生化

3、药物来源于动植物有机体基因工程药物来源于基因工程菌表达生产的药物习惯分法多肽生化药物、细胞生长因子、抗体药物、抗菌肽、酶类药物,多肽、蛋白质类药物分类,多肽类激素、多肽抗生素：消化道多肽、下丘脑多肽、脑多肽、激肽等；动、植物蛋白。酶类与辅酶类药物：蛋白水解酶类、凝血酶及抗栓酶，辅酶Q10等。,生化药物,激素类及神经递质类药物：人生长激素释放抑制因子，人胰岛素，人生长激素细胞因子类药物：人干扰素，人白细胞介素，集落刺激因子，促红细胞生成素酶类及凝血因子类药物：单克隆抗体、疫苗、基因治疗药物、白介素、生长因子、内啡肽、反义药物、人生长激素、促红细胞生成素、肿瘤坏死因子等。,基因工程药物,多肽和蛋白

4、质的物化性质,1.酸碱性多肽是小分子，化学性质与氨基酸类似，含有20个以上氨基酸残基的多肽与蛋白质没有明显界限；蛋白质是呈两性解离的电解质，通常在等电点时，蛋白质的溶解度最小，不稳定，易于从溶液中沉淀析出。各种蛋白质分子都有自己的等电点。,2.离子结合蛋白质存在两性，其表面带有一定量的电荷，可与阴离子或阳离子结合。很多离子与蛋白质形成不溶性的盐，可作为蛋白质的沉淀剂。,多肽和蛋白质的物化性质,多肽和蛋白质的物化性质,3.胶体性质蛋白质分子量大，分子大小达到胶粒1100nm范围。球状蛋白质的表面多亲水基团，具有强烈地吸引水分子作用，使蛋白质分子表面常为多层水分子所包围，称水化膜，从而阻止蛋白质颗

5、粒的相互聚集。蛋白质分子扩散速度慢，不易透过半透膜，粘度大，在分离提纯蛋白质过程中，可利用蛋白质的这一性质除去小分子杂质透析(dialysis)。,4.变性天然蛋白质的严密结构在某些物理或化学因素作用下，其特定的空间结构被破坏，从而导致理化性质改变和生物学活性的丧失，如酶失去催化活力，激素丧失活性，称之为蛋白质的变性作用(denaturation)。变性蛋白质和天然蛋白质最明显的区别是溶解度降低变性并非是不可逆的变化，当变性程度较轻时，如去除变性因素，有的蛋白质仍能恢复或部分恢复其原来的构象及功能，变性的可逆变化称为复性。,多肽和蛋白质的物化性质,3.2 多肽和蛋白质药物的生产方法,利用传统的

6、生化提取法生产 从动植物、微生物等直接提取 通过培养动植物、微生物的细胞得到利用基因工程技术构建工程菌（细胞）进行生产 利用原核生物或简单的真核生物如酵母菌作为工程菌（活细胞），通过将含有编码某蛋白或多肽的碱基序列插入一段DNA载体（如质粒）中，并在工程菌（或细胞）中表达，从而得到相应的多肽或蛋白质。,加拿大SembioSys生物工程公司利用北美洲普遍栽培的高产油料作物红花作为转基因植物“平台”，成功生产出“红花子来源人胰岛素”，该胰岛素顺利通过动物实验与期临床试验，其药代动力学与药效学试验结果与美国礼来利用大肠杆菌表述胰岛素基因生产的重组DNA人胰岛素基本一样。理论上，每公顷红花田可生产出1

7、公斤人胰岛素原料药。,3.2 多肽和蛋白质药物的生产方法,加拿大渥太华大学生物技术研究中心的科研人员也利用另两种高产作物烟草和水稻植株生产出了一种名为“胰岛素样生长因子”(ILGF)的新型降血糖药物。据称，ILGF的降糖效果甚至优于常规口服降糖药。如果ILGF能通过临床试验并成功上市，或将成为前景可期的国际医药市场畅销产品。,3.2 多肽和蛋白质药物的生产方法,蛋白质、多肽提取分离常用的方法：沉淀法（盐析、有机溶剂沉淀、等电点沉淀、结晶等）超滤法膜分离法离心分离法凝胶过滤法离子交换层析疏水相互作用色谱亲和层析等,3.3 多肽和蛋白质药物的分离,基因工程药物分离与纯化的流程,3.3.1 反相高效

8、液相色谱,3.3.1 反相高效液相色谱,3.3.1 反相高效液相色谱,分离机理：用C4C8烷基作配基，将配基键合在固定基质上作为固定相，以水溶性有机溶剂（如甲醇、乙腈、异丙醇）加强酸作流动相（流动相极性大于固定相）。蛋白质分子中既有亲水性基团（-OH，-NH、-COOH、SH等），也有疏水性基团（如苯环、-CH3、-CH2和-CH等）。,在水溶液中，疏水性基团避开水而亲合其他疏水性基团，即溶质分子的非极性部分在水中倾向于与水的接触面减小，促进了其与填料（疏水性配基）的亲合。不同的蛋白质在相同流动相中由于疏水基团数量、种类以及表面分布情况不同，与填料的亲合力也不同，从而得到分离。结果：疏水性强的

9、蛋白质亲合力大，出峰迟；疏水性小的蛋白质就容易被洗脱。,3.3.1 反相高效液相色谱,色谱条件,固定相：常用C4 C8链烃作为配基（键合在固体基质上）为填料。孔径2550 nm。流动相：,加酸作用：SiOH=SiO-H+蛋白质易与SiO-结合很难洗脱，加酸抑制上述平衡向右离解。减小蛋白质的疏水性，使其保留减弱，易被洗脱。,温度：常温,色谱条件,检测：用紫外检测器，检测波长280nm 和220nm。,280nm检测中含有含苯环的酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸的蛋白质，一般蛋白质都含有苯环，所以280nm检测是普遍使用的波长。220nm主要检测肽键；所以所有蛋白质普遍适用。,洗脱方式：梯度洗脱逐渐增加洗

10、脱强度。,蛋白质的分离一般就需要用梯度洗脱，否则有些蛋白质已达到突跃会很快被洗脱下来，有些蛋白质还远离突跃区，实际上无法被洗脱。而有机小分子的反相色谱中未发现此种突跃现象。实际工作中梯度洗脱时间约为2060min，B液的变化速度约为每分钟5%15%。,色谱条件,Influence of Particle Size on the Separation effect,应 用,最大优点：分离度最高；最大缺点：容易使蛋白质变性失活。例子：人的胶原蛋白I型1和2键的色谱分离,3.3.2 疏水相互作用色谱,概念：用适度疏水性的配基作固定相，以盐水体 系作流动相，用疏水作用来分离生物大分子化合物的液相色谱法

11、，叫疏水相互作用色谱(Hyd rophobic Interaction Chromatography,HIC)或疏水作用色谱。,在HIC中：固定相表面有疏水性基团，（如-CH2，-CH3，-ph等）。蛋白质分子是一个外部有亲水层包围，内部有疏水核的具有四级结构的复杂体系。蛋白质表面亲水性很强，但也有一些疏水性的基团，同时团状的蛋白质还存在疏水基团较多的裂隙。,分离原理,分离原理,在不同的介质中裂隙的伸展和收缩程度不同，从而使疏水基团暴露的多少也不同。疏水色谱是利用盐水体系中样品组分的疏水基团和固定相的疏水配基之间疏水作用力的不同而达到分离的目的。,配基和蛋白质分子之间的吸附推动力和样品组分的洗

12、脱机理（即：溶质在色谱中的保留行为）：,“疏溶剂化理论”：蛋白质与配基的结合是由于溶质分子有一个减少其与水接触的非极性表面的倾向，它们在盐水溶液中，两个非极性的表面趋向于避开水相而互相接触。溶质和疏水配基的结合是伴随着它们非极性表面暴露在水中的面积的多少而进行的。蛋白质在盐水体系中，有一倾向产生：避开水相而吸附在固定相上。生物物质界面自由能比水低，与表面自由能低的固定相产生亲合力,结论,疏水作用色谱中，蛋白质在固定相上的保留性质是四个可变因素综合作用的结果。这四个因素是：样品分子、填料、流动相组成及性质和温度。,填 料,由基质和键合在基质上的配基两部分组成。（基质配基）,基质：有“软”、“硬”

13、两类，它们必须有25100nm的内孔径或 有较大间隙的网状结构（孔径要大）。软基质：交联琼脂糖凝胶，交联葡聚糖凝胶、高分子聚合物。硬基质：主要是大孔径硅胶。,配基：是一些含氮和氧原子的中等疏水性基团；or是丁基、苯基这些疏水基团键合在一个亲水性表面。,色谱条件,主要有：a.具有中等疏水性表面的填料；b.盐析性盐的水溶液为流动相；c.紫外检测器检测，检测波长220或280nm；d.流动相pH值接近中性；e.由高盐浓度到低盐浓度的梯度洗脱，梯度时间2060 min；f.常温或4下操作。,1、流动相的组成,有A液和B液两种。A液：疏水性浓盐水溶液，并含有缓冲液作用的盐以稳定pH值。常用的A液为1.0

14、3.0mol/L(NH4)2SO4加0.010.05mol/L磷酸盐缓冲液；B液：稀的缓冲液，浓度与A液中的缓冲作用的盐的浓度相等。常用的B液为0.010.05mol/L磷酸盐缓冲液。盐有两类。盐析性盐：使蛋白质的构象稳定，会促进蛋白质自身间的疏水作用而析出，or促进蛋白质与配基之间的疏水作用而保留在柱上。不失活，溶解度减小。常用：(NH4)2SO4盐溶性盐：提高蛋白质的水溶性，同时会使蛋白质变性。如硫氰酸盐、盐酸胍等会。,2、流动相的pH值：一般地pH 48；常选 pH 7左右。,3、温度 一般在常温或低于常温下操作。HIC中蛋白质的保留对温度较敏感。在HIC体系中蛋白质处在活性状态，T使蛋

15、白质的团状结构伸展，暴露出更多的疏水基团，疏水作用增强，保留值增大。（其他色谱，T保留增大）T传质加快，使保留减小。（对所有色谱均适用）总之，在疏水色谱中，比大，T，保留增大。,4、洗脱方式：梯度洗脱。（高浓度盐低浓度盐）,1、流动相的组成,疏水作用色谱的应用,只用于生物大分子的分离，不用于有机小分子分离。优点：1、其色谱条件温和，蛋白质活性回收率高，一般都在85%以上。2、不用有毒和昂贵的有机溶剂。3、分离性能好。4、高浓度盐的样品可以直接进疏水作用色谱柱进行分离。5、对生物工程产品的粗品可直接上样，一次完成蛋白质的初步分离、脱盐和复性三个目的。,例如：基因重组人干扰素r是一种基因工程产品，

16、其粗品是7mol/L盐酸胍溶液。干扰素在盐酸胍溶液中处于可逆性失活状态。因盐浓度太高无法直接上其他柱，除去盐酸胍后干扰素又容易析出来。若使用疏水作用色谱柱，将此样品直接进样，既脱除了盐酸胍，又达到了复性的效果。而且一步分离后，干扰素纯度可达到90%。,IFN-r粗品的HIC分离,疏水作用色谱的应用,疏水作用色谱与反相色谱的区别,相同：蛋白质与填料之间的保留是疏水力作用的结果。区别：1）填料不同 HIC，表面中等疏水性作为配基；RPC，表面是烷基C48等疏水性强的为配基。2）疏水力不同 HIC，疏水作用较弱；RPC，强。,两色谱中洗脱液主要成分不同（正是上面的差异引起的）,在HIC中可以加入少量

17、有机溶剂以增强流动相的洗脱能力；在RPC中加入盐来改变蛋白质的保留值。,疏水作用色谱与反相色谱的区别,3.3.3 体积排阻色谱,将分子按大小进行分离的重要色谱技术；根据分离的对象是水溶性的化合物还是有机溶剂可溶物，又可分为凝胶过滤色谱（GFC）和凝胶渗透色谱（GPC）凝胶过滤色谱一般用于分离水溶性的大分子，如多糖类化合物。凝胶的代表是葡萄糖系列，洗脱溶剂主要是水。凝胶渗透色谱法主要用于有机溶剂中可溶的高聚物(聚苯乙烯等)相对分子质量分布分析及分离，常用的凝胶为交联聚苯乙烯凝胶，洗脱溶剂为四氢呋喃等有机溶剂。,1、原理凝胶过滤色谱(Gel Filtration Chromatography GF

18、C)又称为分子排阻色谱(Size Exclusion Chromatography SEC）原理见图解。,凝胶过滤色谱,凝胶过滤色谱,2、凝胶过滤色谱的优点 分离条件温和，蛋白质收率高，重现性好。分离的分子量范围广。易于操作。3、凝胶过滤色谱的缺点处理量小，时间长，效率低。,凝胶过滤色谱,凝胶过滤色谱填料,传统的填料用的是葡聚糖交联凝胶，凝胶刚性不理想流速不快，特别是前者压力和盐都会导致凝胶收缩，所以难提高流速，也不容易制备成小颗粒的高分辨率的填料。新填料将葡聚糖凝胶和琼脂糖凝胶混合造粒，再经过高度交联制备出流速快、重复性好、分离效果更好的新型凝胶过滤填料，如superdex系列及琼葡糖凝胶系

19、列都是用这样的。它比普通的葡聚糖凝胶填料相比流速快，刚性好，颗粒均匀，没有非特异吸附，装填后体积不收缩，因此可以在高流速下保持很好的分离效果可以制备成平均粒径为34m或13 m高效填料。,概念：利用离子交换树脂作为吸附剂，将溶液中的待分离组分，依据其电荷差异，依靠库仑力吸附在树脂上，然后利用合适的洗脱剂将吸附质从树脂上洗脱下来，达到分离的目的。,3.3.4 离子交换色谱,离子交换树脂的结构,其结构由三部分组成：不溶性的三维空间网状结构构成的树脂骨架，使树脂具有化学稳定性和机械强度；是与骨架相联的功能基团；是与功能基团带相反电荷的可移动的离子，称为活性离子，它在树脂骨架中的进进出出，就发生离子交

20、换现象。,离子交换树脂的结构-网络骨架,苯乙烯系、丙烯酸系、酚醛系、环氧系,离子交换树脂结构,骨架：接有功能基团，本身是惰性,功能基团：连接在骨架上，可与相反离子结合,待交换分子：在吸附阶段可与活性离子交换，与骨架上的功能基团结合,活性离子：与功能基团所带电荷相反的可移动的离子,活性离子为阳离子，称阳离子交换树脂，与阳离子发生交换活性离子为阴离子，称阴离子交换树脂，与阴离子发生交换,离子交换法是通过带电的溶质分子与离子交换剂中可交换的离子进行交换而达到分离纯化的方法。,离子交换层析原理,主要依赖电荷间的相互作用，利用带电分子中电荷的微小差异而进行分离。选择适当条件可使一些溶质分子变成离子态，通

21、过静电作用结合到离子交换剂上，而另一些物质不能被交换，这两种物质就可被分离。带同种电荷的不同离子虽都可以结合到同一介质上，但由于带电量不同，与介质的结合牢度不同，改变洗脱条件可依次被洗脱而达到分离的目的。,离子交换层析原理,离子交换层析原理,开始,吸附,解吸,解吸结束,再生,样品,解吸剂,再生剂,-,-,-,-,-,+,+,-,-,-,-,-,-,-,离子交换色谱优点1.处理量大，操作简单。2.应用广泛。离子交换色谱缺点样品要除盐，分离效果不如亲和和疏水色谱。,自 学,3.3.5 膜蛋白色谱3.3.6 高效置换色谱3.3.7 贯流色谱,1 亲合色谱的原理AC是吸附色谱的一种。但溶质的保留是一种

22、特异的有选择性的亲合力。填料只是有选择地对一种生物大分子或一类生物大分子有吸附，对其他物质无吸附作用洗脱时先被分离，分段洗脱或梯度洗脱再将生物大分子从填料上洗脱下来，从而达到分离目的。,3.3.8 亲和色谱,亲合色谱的原理,亲合色谱填料：是在基质上键合一个特殊的配基（配位体）制得。例如 酶的底物、产物、抑制剂、辅酶、变构效应物，抗物的抗原，激素的结合蛋白等都可以作为 配位体用于分离对应的酶，抗体和激素。有些配体可以用于一类化合物的吸附分离。如伴刀豆球蛋白可以特异地吸附糖蛋白；三嗪染料作配基也会对某些蛋白质有选择性吸附。,配体与分离对象的作用：是一种特异的生物亲合力，是配体与被吸物之 间范德华力

23、、疏水力、静电力和其他力的综合作用的结果。这种综合作用力是有选择性的，只对一个或一类生物大分子起作用，对其他物质不起作用。故AC选择性很高。,亲合色谱的原理,填料（由基质、间隔臂和配体三部分组成）,AC填料的基质：分两类。一类为有机聚合物，用得最多的是多糖聚合物，如纤维素，交联葡聚糖、交联琼脂糖等。还有聚丙烯酰胺也是一类常用的基质。多糖基质表面羟基密度大，易制得柱容大的填料，而且其表面羟基对蛋白质无非特异性吸附。但这类基质机械 强度低，不耐高压。第二类是多孔玻璃和硅胶。这类基质机械强度高，但柱容较小，表面硅羟基的非特异性吸附难以完全克服。,填料（由基质、间隔臂和配体三部分组成）,实验技术,1、

24、装柱柱子有玻璃柱和不锈钢柱两种。软基质填料装在玻璃柱内，用于常压色谱。硅胶和多孔玻璃基质填料可装在不锈钢柱内用在高效液相色谱上。玻璃柱采用普通的湿法装柱，溶剂应不损害配体的活体，一般用缓冲溶液作分散剂来装柱。不锈钢柱一般采用匀浆法装柱，但装柱压力要低一些。分散剂常用亲水的醇类。,实验技术,2、洗脱方式AC最常用的洗脱方式是分段洗脱，还有脉冲洗脱和梯度洗脱。分段洗脱的过程是：平衡柱子(平衡液)上样平衡液洗涤洗脱液洗下目标蛋白再生平衡第二次上样脉冲洗脱是在平衡、上样、洗涤后，用一段少量的洗涤液让其象一条密集的脉冲带流过柱子，以洗下某个特定的蛋白。,3、流动相（有平衡液和洗脱液两种）,平衡液：起平衡

25、柱子和上样后洗去不吸附的杂蛋白及其他杂质的作用。其成分是稀盐缓冲溶液。洗脱液：是使吸附在柱子上的蛋白质解吸的流动相。非特异性洗脱：利用洗脱液的组成、浓度、pH值和温度的改变使蛋白质与配体作用减弱而洗脱下来。特异性洗脱：利用一种对目标蛋白质也有亲合作用的游离配体使其与固定相上配体产生竞争作用把蛋白质拉下 来的洗脱。,4、共价亲合色谱,是一种特殊的AC。利用一种特殊的配体，与待纯化的蛋白质形成某种不太强的共价健，将蛋白质固定在柱子上。待洗去杂蛋白后，用适当的化学方法，将被固定的蛋白质重新释放出来。,硫醇二硫化物交换色谱 可以用来纯化许多含硫醇的蛋白质,将谷胱甘肽N2HCH(COOH)CH2CH2C

26、ONHCN(CH2SH)CONHCH2COOH先键合到基质上得到(结构见右)。简写为：,再与二吡啶基二硫化物 反应得到填料。含硫醇基的蛋白质可牢固地固定在定固定相上，必须用含硫醇基的洗脱液将其洗脱下来，柱子还得用二吡啶基二硫化物再生。,硫醇二硫化物交换色谱,5、其他色谱条件,上样体积流速温度蛋白质浓度的影响,6、柱子的再生与保护,再生：用洗脱液充分洗涤后即可再次进样。但是重复使用几次后对目标蛋白的吸附率常会降低。所以用2mol/L KCl加6 mol/L尿素洗涤。保护：柱子平时应保存在4。柱内充满稀缓冲溶液。为了防止细菌，液体可含万分之二的叠氮化钠。,应 用,亲合色谱应用于酶、蛋白质等生物大分

27、子的分离纯化。,例如：淀粉酶的分离可以使硅胶为基质、淀粉为配体的亲合色谱柱来完成。以去离子水为平衡液，以0.15mol/L磷酸盐缓冲溶液，pH7.0作洗脱液，从工业粗酶中纯化淀粉酶，活性回收率为93.6%，纯化后的比活提高了20倍。柱子寿命为600次以上。吸附容量4.6mg/g填料。色谱图见右图。,淀粉酶的亲合色谱分离,3.3.9 电泳分离技术,电泳：带电粒子在电场作用下向着与其自身所带的电荷相反的电极的移动。电泳技术：样品以一支持物为载体，在一定的电解质溶液中，各组分在电场的作用下，以不同的速度进行迁移，从而得到分离。电泳技术分类：按支持物的不同，分为：凝胶电泳、纸上电泳和薄膜电泳等。按操作

28、原理分为：一般电泳、等速电泳、等电聚焦电泳和免疫电泳 等。对分离物的要求：在介质中必须带电。,聚丙烯酰胺凝胶电泳,原理：不同带电粒子在同一外加电场作用下泳动的速度是不同的，泳动度取决于带电颗粒的性质，颗粒所带净电荷越多、直径越小，越接近球形、泳动速度越大。介质pH值（蛋白质为两性电解质，有一等电点，在不同pH值下所带净电荷的符号及数量均不同，在电场中的泳动速率也就不同了。）电场强度（电场强度越高，粒子泳动速度越快。）离子强度（介质离子强度越大，粒子的泳动越慢。一般在0.020.2之间。）电渗等实验条件有关。,2、凝胶的化学结构,由丙烯酰胺单体聚合成长链，长链之间用N,N-甲叉双丙烯酰胺交联成多

29、孔状结构。孔的大小可以用双丙烯酰胺的浓度来调节。浓度增大，网状结构的空隙（孔径）减小。,形成凝胶的反应式,具有很高的分辨率。大小不同的分子在通过网状结构的凝胶的空隙泳动时受到的阻力不同，大分子物质受到的阻力比小分子的大。这样就使聚丙烯酰胺凝胶电泳兼有分子筛和电泳的双重功能，提高了分辨力。凝胶空隙的大小可调节，以适应不同分子量的样品。聚丙烯酰胺凝胶电泳中电渗现象很小。凝胶机械强度较好，弹性大，易保存。丙烯酰胺纯度高，不会污染样品。,3、丙烯酰胺凝胶电泳的优点,4、连续与不连续平板凝胶电泳,凝胶电泳分为：连续和不连续两类。连续电泳：是指整个电泳系统所用的缓冲液、pH值和凝胶组成都相同。不连续电泳：

30、是指在电泳系统中采用了两种或两种以上的缓冲液、pH值和凝胶。优点：稀的蛋白质样品在电泳过程中被浓缩，提高了分辨力。,聚丙烯酰胺凝胶电泳常用的是平板电泳仪。装置见下图,连续(a)与不连续(b)平板凝胶电泳示意图,SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,原理：是一个在缓冲液中加有SDS，并且样品事先用含SDS的溶液作解离处理的电泳体系。当蛋白质在过量的SDS溶液中加热时，天然蛋白质的球形状态就变成线形。变性后的蛋白质，几乎是定量地 1克蛋白质结合1.4g SDS，使蛋白质的亚基多肽带上了大量的负电荷。在电场中这种电荷密度相等的粒子严格按照其分子的大小具有不同的流动度。样品按多肽分子量的大小分离，研究人员可以用已

31、知分子量的样品作对照测定未知物的肽链大小。,凝胶电泳的应用,广泛用于分离蛋白质、酶和核酸等生物大分子及其他带电的有机物。生物大分子的分离及分子量测定样品组分在电泳中按照其带电情况和分子大小不同而有不同的迁移率，在胶板上得到分离。在 SDS不连续凝胶电泳中，样品组分按分子量大小排列，分子量的对数与迁移率之间有一个线性关系。因此在电泳时加入标准分子量的蛋白质标准样，可以测定未知样的分子量。样品组分的回收凝胶电泳可以作g级样品的分离制备。回收样品组分的方法有：扩散洗脱和电泳洗脱。,聚焦电泳（等电点聚焦）,用于分离具有不同等电点的物质。不同蛋白质有不同的等电点。当蛋白质或多肽放在一个通直流电而产生的一

32、个pH梯度的体系中时，不同的蛋白质在电场作用下会向不同的方向移动，并聚焦在相应于其等电点的pH位置处，即为等电聚焦，或叫聚焦电泳。,等电聚焦的特点,分辨率高。可以将等电点相差0.010.02pH单位的蛋白质分离开。不管蛋白质样品加在什么部位，由聚焦作用使其总是聚焦到等电点处，所以很稀的样品也可 以进行分离。这一点是其优于一般电泳和色谱的地方。分离是依据等电点不同而进行的，所以重现性很好。用于蛋白质及多肽的分析及等电点的测定，也可以用于分离和制备。一般电泳中随着时间加长和泳动距离的加大，物质区带因扩散作用而加宽。等电聚焦中不存 在这个问题。,缺点：样品溶液要求无盐。样品组分分别聚焦在其等电点处，

33、所以对于一些在其等电点处不溶或变性的蛋白质此方法不适用。,等电聚焦的特点,3.4 蛋白质的分析鉴定,3.4.1 质谱分析原理：质谱仪是利用电磁学的原理，使带电的样品离子按质荷比进行分离的装置。离子电离后经过加速进入磁场中。其动能与加速电压及电荷Z有关。根据质量分析器的工作原理，可将质谱仪分为动态和静态仪器两大类，分离生物大分子多采用电喷质谱法，属于动态质谱仪。基本原理是生物大分子在很高的电场下电离。样品溶液以很低的流速，在高的电场下使生物分子从毛细管中流出來。,3.4.2 核磁共振,核磁共振波谱是将具有磁矩的核放入磁场后，用适宜的频率的电磁波照射，它们就会吸收能量，发生原子核能级的跃迁，同时产生核磁共振信号，得到核磁共振波谱。在生物学方面主要研究生物大分子的结构和分子量。到目前为止，采用1H 2D-NMR（二维NMR）能解决的最大蛋白质分子量在10000Da左右。如果采用杂核多维NMR技术，能解决的最大蛋白质分子量大在25000Da左右。,作 业,多肽及蛋白质类药物的分离方法有哪些?列表对比各方法的优缺点。,