医学肿瘤基因及其调控机制.ppt

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1、肿瘤基因及其调控机制,第一节 癌基因一、癌基因的基本概念,逆转录病毒的研究对于阐明人类癌症的发生机理具有重要意义。逆转录病毒的基因组中除了病毒本身复制所必需的基因，如编码病毒核心蛋白（gag）、外壳糖蛋白（env）及逆转录酶（pol）等的基因外，还包括一个能引起细胞恶性转化的基因。这种基因就是现在为人们 所熟知的癌基因（oncogene，onc）。,由于最初是在病毒中发现的，所以称之为病毒癌基因（v-onc）。后来发现，在许多动物的正常细胞中都存在着与 v-onc 相对应的DNA序列，称之为原癌基因（protooncogene）或细胞癌基因（c-onc),现有资料表明：细胞癌基因与病毒癌基因基

2、本上是同源的，但用DNA测序技术可查明，在二者之间可以有一个或几个碱基对的差别。所以现在认为，细胞癌基因是病毒癌基因的前体，而病毒癌基因则是细胞癌基因的转导翻版；,细胞癌基因在长期进化过程中极为保守，在无脊椎动物（如果蝇）的基因组中就可以找到与哺乳动物细胞癌基因基本上同源的序列。所以实际上在正常情况下，细胞癌基因不仅对机体无害，而且可能在发育过程中，以至于对生命的维持起着重大的作用：,细胞癌基因在正常细胞中可以有低水平的表达，而在癌组织中与其相对应的活化癌基因的表达水平却比它高的多。,二、癌基因的分类,较早期的分类是根据癌基因的产物在细胞内的定位，将其区分为胞质癌基因和核癌基因两大类。随着癌基

3、因数量的增加，这一分类显得不够完善。近年来，人们趋向于用癌基因蛋白的结构与功能及其在细胞内的定位来进行分类。,按照这一原则癌基因可分为五大类：生长因子类 酪氨酸激酶类 丝氨酸苏氨酸激酶类 GTP结合蛋白（G蛋白）类 核结合蛋白类,Demezuk（1991）对癌基因作了全面的综述，列出了87种癌基因，并进行了分类。鉴于近年来又有一些新的癌基因和抑癌基因出现，对此作了一些增补。现以其资料为基础，对五举癌基因分别介绍如下：,1.生长因子类：属于这异类的有sis,int-2等五个癌基因。特点是其产物与某些生长因子极为相似：例如，猴肉瘤病毒v-sis癌基因的蛋白产物p28与血小板生长因子（PDGF）链几

4、乎完全相同。因此sis蛋白可模拟PDGF同其受体结合，刺激细胞过度增殖。,受病毒感染的细胞可向周围分泌生长因子，后者又反过来向分泌它的细胞连续发放增殖信号，最终导致细胞癌变。这种癌变过程中的独特现象称为“自分泌”（autocrine)。小鼠乳腺瘤病毒（MMLV）的int-2癌基因产物gp27-34类似于成纤维细胞生长因子（FGF），其过度表达可诱发小鼠乳腺新月形癌。,2.酪氨酸激酶类：属于这一类的癌基因较多，现在较明确的有21 种。根据其功能的差别，还可分成两个亚类：细胞表面生长因子受体 膜结合的酪氨酸激酶,细胞表面生长因子受体：包括erbB-l，erbB-2/HER/neu等7个癌基因。禽成

5、红细胞瘤（AEV）病毒癌基因erbB-l的蛋白产物pl70与上皮细胞生长因子受体（EGFR）的氨基酸序列高度同源。因此，它可模拟EGFR进行工作。即使在没有外源性刺激时，也能不断地使胞内靶蛋白发生酪氨酸激酶反应，从而连续地向细胞核发放增殖信号，导致细胞过度增殖。,ErbB-2的蛋白产物pl85也与EGFR类似。猫肉瘤病毒癌基因fims的蛋白产物gp105165 则与集落刺激因子（CSF-l）受体相似。,膜结合的酪氨酸激酶：包括src-l，abl等14个癌基因。Rous肉瘤病毒（RSV）癌基因src-l的蛋白产物 pp60是第一个被人们分离，并研究得最多的癌蛋白，分子量为 60 kD，长 526

6、个氨基酸残基，分布在质膜内侧。pp60是专一地使蛋白质分于中的酪氨酸残基发生磷酸化的蛋白激酶，称为酪氨酸专一性蛋白激酶（用P-tyr表示）。,在正常细胞中，P-tyr仅占总蛋白磷酸化的13000（其余由丝氨酸专一性蛋白激酶磷酸化，占90，还有10由苏氨酸专一性蛋白激酶磷酸化），而在被RSV转化的细胞中，P-tyr升高了 10倍。本亚类中其他癌基因的产物也具有 P-tyr活性。前述的 erbB-l等生长因于受体均具有P-tyr活性，因而推测本亚类癌基因也可能参与细胞生长的调控。,已知有一种含酪氨酸的粘着斑蛋白（vinculin）是 pp60 P-tyr蛋白激酶的底物之一。它位于质膜内侧的吸附斑中

7、，而组成细胞骨架微丝结构的肌动蛋白束正好固定在吸附斑上。在正常细胞中，粘着斑蛋白的磷酸化仅占该蛋白磷酸化的1，而在转化的细胞中则上升至20。同时发现在RSV转化细胞株中吸附斑大量减少，其肌动蛋白束的结构遭到严重破坏。,Pp60 P-tyr的另一种与细胞骨架有关的靶蛋白是p36，它结合在含有微管蛋白，肌动蛋白和肌球蛋白的细胞骨架上，它的酪氨酸被 pp60 P-tyr磷酸化后也可导致细胞骨架破坏。由此可见，RSV病毒转化的细胞中src癌基因的过度表达，是导致细胞骨架微丝、微管系统破坏的重要原因。,3.丝氨酸苏氨酸激酶类：关于这类癌基因只列举了raf-1,mos和pim-1三种，它们的蛋白产物都是定

8、位于胞质的丝氨酸苏氨酸专一蛋白激酶，与第二信使CAMP调节系统有密切关系。已知有一种CAMP依赖性蛋白激酶就是丝氨酸专一性蛋白激酶，具有传递CAMP的信号及调节基因表达的作用。,4.GTP结合蛋白类 此类包括ras族的H-ras，K-ras，N-ras三个癌基因，以及在垂体及卵巢肿瘤中发现的gsp癌基因。ras族癌基因是目前研究得最多的癌基因。从人体肿瘤分离到的活化癌基因都属于ras族，其基因产物p21ras蛋白的分子量约21kD，长188189个氨基酸残基，分布于质膜内侧。具有GTP依赖的GTPase活性，其一级结构和生化特性和“G蛋白”十分相似。,G蛋白是媒介多肽激素受体的信号与细胞内效应

9、器腺苷环化酶之间的偶联因子，通过激活或抑制腺苷环化酶的活性直接或间接地调节cAMP的浓度，进而调控细胞的生长。ras族原癌基因可能象G蛋白一样参加腺苷环化酶信号系统的调控。ras族癌基因在12，13或61位氨基酸残基的点突变将使 p21ras失去水解的活性，并使细胞过度增殖。,5.核蛋白类：属于这一举的癌基因有myc,myb,fos等12个。其中研究得最为详尽的是 c-myc。c-myc最早发现于禽粒细胞瘤病毒（AMV）中，并广泛分布于从酵母到人的基因组中。它含有 3个外显子，编码一种含439个氨基酸，分子量为62kD的蛋白质。该蛋白定位于细胞核内，属DNA结合蛋白，可同单链或双链DNA结合。

10、,c-myc 的表达具有组织专一性，细胞周期特异性和发育阶段特异性。在正常组织中 c-myc 可有低水平表达，而在大多数实体肿瘤中，其表达明显增高。在癌前病变和一些良性肿瘤中，也可见到表达增高。一般认为，c-myc 的扩增是导致原癌基因活化的主要途径。,以上资料表明，c-myc蛋白可能是一种调控细胞增值和分化的调控蛋白，它可以识别和结合到基因组中特定的识别序列，并活化那些与细胞增殖和分化有关的基因。c-myb 也有类似性质，主要在造血细胞分化的某些特定阶段表达，而在一些造血系统肿瘤中其表达可增高。,近年来陆续发现了一些新的癌基因，它们在癌变过程中起着重要的作用：int-2 jun met PC

11、NA Ki-67核抗原 mdm2,int-2 定位于 7q31，编码分子量为 27kD的蛋白，该蛋白的部分结构与成纤维细胞生长因子具有同源性。它具有刺激表皮细胞生长的作用，但需要与其他基因协同才能完成细胞的恶性转化。Int-2基因的扩增率在乳腺癌中达19，但扩增的倍数不高。一般认为，该基因的高表达与肿瘤的转移，复发和预后不良有关。,jun 定位于lp3132，编码分子量39kD的蛋白。蛋白定位于核内。Jun与随后发现的junB，junD都是核转录因子，与c-fos形成转录调节复合物，其蛋白产物FOSJun能与其他反式因子如视甲醛受体（RAR）、糖皮质激素等相互竞争，对转录起调节作用。,met

12、定位于7p31，其转录产物有多种，分别为9.0,7.0,6.0,5.0和3.2kb mRNA。蛋白产物主要有两种，分别为 ppl40-145met肝细胞生长因子受体和 pp65tpr-met活化融合蛋白。最初确定其为转化基因是在以MNNG处理的人骨肉瘤细胞系中，由于l号染色体的tpr序列插入到7号染色体的 met基因形成tpr-met重排而使其活化。,其主要功能为促进肝细胞生长及诱发细胞转化。c-met基因的活化与多种肿瘤的发生有关，其活化机理主要为扩增和重排。现已证明，9.0 kb c-met mRNA及其蛋白产物在胃癌和肝癌等肿瘤中的表达高出正常组织许多倍，而且表达程度与预后有关。,PCN

13、A 增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）是一种在细胞增殖周期中合成和表达的36kD蛋白质，主要在G1后期及S早期在核仁中合成并在细胞核内聚集，因此进入细胞周期的正常细胞和肿瘤细胞都含有PCNA。采用PCNA单抗定位研究PCNA，可以作为判断细胞增殖情况和预后的一种手段。,Ki-67核抗原 Ki-67存在于增殖细胞核内，在G1中期开始表达，S期和 G2期增多，M期达到高峰，G0期细胞阴性，因此Ki-67在调节细胞增殖中起重要作用。用免疫组化法证明，癌组织中阳性细胞数明显高于正常细胞和良性肿瘤，因此对鉴别良恶性病变有一定实际意义。Ki-6

14、7表达水平的高低与肿瘤预后之间也有密切关系。,mdm2 mdm2基因最初是从一个含有双微体（DM）的自发转化的 BALB3T3细胞系中克隆出来的一个高度扩增的基因，定位于12ql314上，该基因全长由2372个碱基对组成，编码区全长1473个碱基，编码一个长度为491个氨基酸践基的蛋白质，分子量为90kD。,动物实验己证明，mdm2可使细胞转化并具有成瘤性。在某些恶性软组织肿瘤，骨和脑肿瘤中发现了mdm2扩增，说明其可能与这些肿瘤的发生有关。mdm2癌基因不仅可通过扩增而直接致癌，而且可作用于抑癌基因p53使正常的p53失活而间接致癌。,三、癌基因的活化机理,细胞癌基因存在于正常细胞中，但在正

15、常情况下并不表现出致癌性，只有在各种外因和内因作用下使细胞癌基因活化，才能导致肿瘤发生，癌基因活化的机理可能多种多样的，但主要的有以下6种：,1.转导（transduction）2.点突变（point mutation）3.插入突变（insertional mutation)4.易位(translocation)5基因扩增（gene amplification）6.基因甲基化的改变,1.转导（transduction）在漫长的生物进化过程中，现在的逆转录病毒的祖先在感染正常细胞的同时，通过复杂的遗传学重组和突变，将正常细胞的细胞癌基因整合到其基因组中，并使之改变成活化的病毒癌基因。带有病毒癌基

16、因的逆转录病毒在感染适当的动物时，可使之发生肿瘤。,2.点突变（point mutation）美国的 Weinberg，Wigler和 Cooper等实验室于 1983 年分别从不同的膀胱癌细胞系中分离DNA，用以转染NIH3T3细胞系，可使之发生恶性转化。从转化细胞中已分离到活化癌基因的分子克隆，并证明其与Harvey鼠肉瘤病毒的癌基因（v-Ha-ras）非常相似。,在人类正常细胞中也发现了其对应物(c-Ha-ras),Barbacid与Weinberg的研究组分别发现，膀胱癌中的活化癌基因与其对应的正常癌基因之间只有一个碱基对的差别，即(c-Ha-ras)基因的第一个外显子(exon)所编

17、码的多肽链氨基端第 12位密码子上发生了有突变，其鸟瞟呤被胸腺嘧啶所取代，使其编码的甘氨酸被氨酸所取代。这一单个碱基对的点突变，看来就是正常细胞癌基因变成活化癌基因的关键。,3.插入突变（insertional mutation)逆转录病毒中的慢病毒本身不含有癌基因，但能以前病毒的形式插入到宿主细胞癌基因的邻近而将其激活。,在这方面最典型的例子是禽白血细胞增多症病毒（AW）。新生雏鸡在感染ALV后612月才产生肿瘤，在癌前期观察到法氏囊中大量细胞受到病毒感染，而且ALV的DNA插入到不同细胞基因组的不同位点。,但是，在肿瘤细胞中前病毒DNA却存在于所有细胞基因组的同一位点，说明它们是由ALV的

18、DNA插入基因组适当位点的一个细胞所形成的克隆。在肿瘤细胞中ALV的DNA可发生部分缺失，但至少项保存一部分。,Hayward等进一步证明，在大多数肿瘤中 ALV前病毒插入到细胞癌基因的5端，并处于相同的转录方向。ALV前病毒的长末端序列（LTR）经常缺失或失活，所以可能其 3端 LTR为转录提供强有力的启动子，从而产生大量与前病毒DNA相连的c-myc序列。,在有些情况下，前病毒虽插入到c-myc的5端，但处于相反的转录方向，或插入到的3端而处于相同的转录方向。这两种情况也可加强cmvc的转录，但其作用机理尚不太清楚。,同时CooPer等发现，从这类肿瘤中提取的DNA可转化NIH3T3细胞，

19、但奇怪的是，从中分离到的转化基因既不是ALV的DNA，也不是活化的c-myc，而是位于另一位点的片段，称之为Blym，它编码一个分子量约为7kD的多肽。由此可见，在诱发的肿瘤中至少涉及两个癌基因的活化。,4.易位(translocation)在人类巴基特淋巴瘤的细胞系中，发现第8号染色体长臂远端片段易位至第2，22和14号染色体的一定部位。,现有资料证明，这些部位分别含有免疫球蛋白轻链Ig,Ig 和以及重链 IgH基因。由于这些部位经常进行着活跃的转录，可以提供强有力的启动子，而易位的第8号染色体片段已证明含有细胞癌基因c-myc,可以被相邻的启动子活化。,还有资料指出易位的c-myc的3端与

20、免疫球蛋白基因的3端相连。这一情况类似于上述ALV前病毒的插入，即c-myc插入到启动子的下游，但处于相反的转录方向。,5基因扩增（gene amplification）在人的慢粒白血病细胞系（HL-60）中，发现了 c-myc的扩增，表现为双微体（dounle minutes，DMs）和均染区（Homogeneous staning region,HSR）的形成，可通过原位杂交法加以证实。,6.基因甲基化的改变 在肿瘤细胞中可发现癌基因和抑癌基因的甲基化改变，表现为癌基因的低甲基化或去甲基化，或抑癌基因的异常甲基化。有报道在胃癌细胞中发现了c-Ha-ras癌基因的低甲基化，而低甲基化可导致c

21、-Ha-ras癌基因的过度表达。,第二节 抑癌基因,抑癌基因(antioncogene)过去常称之为肿瘤抑制基因（tumor suppressor gene）。关于抑癌基因存在的概念由来以久，人们最初从肿瘤细胞染色体特定部位的缺失推测它的存在。,细胞遗传学的发展在这方面提供了进一步的证据。当用正常细胞同肿瘤细胞杂交，或将某一条正常细胞染色体导人肿瘤细胞中时，观察到肿瘤细胞的恶性表型受到抑制，从而推测在正常细胞染色体上存在着抑癌基因。,但最终确定其存在，必须分离到抑癌基因，并对其结构与功能进行详细的分析。1986l987年国际上有3个实验室成功地分离到第一个抑癌基因Rb基因的cDNA克隆从而使抑

22、癌基因研究进入了分子生物学时代。,近年来又陆续发现了一些新的抑癌基因。目前对抑癌基因尚无明确分类，但近年来由于抑癌基因数量的增多，而其中一些基因在功能上与传统的抑癌基因有很大的不同，为便于了解起见，现将其分成两大类：,表现为丧失功能的抑癌基因（传统的抑癌基因）Rb基因 FAP 相关的抑癌基因 p53基因 p21Cipl基因 p73基因 p27Kipl NF1基因 FHIT基因 WT1基因 PTEN ErbA基因 Kreyl基因 DPC4基因 INK4基因,参与DNA修复抑癌基因（新发现的抑癌基因）错配修复基因 BRCA1基因 ATM基因,一、表现为丧失功能的抑癌基因,1.Rb基因 视网膜母细胞

23、瘤(retinoblastoma)是婴幼儿眼恶性肿瘤中最常见的一种。大量研究资料证明，位于人类细胞第13号染色体长臂13ql4区域的视网膜母细胞瘤易感基因（retinoblastoma susceptibility gene，Rb）的缺失或失活，是导致肿瘤发生的主要原因。,Rb基因在遗传学上是隐性的，即必须两个等位基因同时缺失形成所谓的缺失纯合子，或一个等位基因缺失而另一基因突变而失活，才能导致基因功能的丧失。,等位基因的缺失或失活可由以下情况引起：染色体丢失（13-）染色体部分缺失（13q-）等位基因突变（13qRB I3qrb）,因此，肿瘤细胞的基因型有以下几种可能性：13qrb13qrb

24、 13qrb 13q-13qrb 13-13q-13q-13-13-,有关脂酶 D（esterase D，ED）的研究究揭示了一个饶有兴趣的现象。某些视网膜母细胞瘤患者的红细胞脂酶D活性只有正常人的一半，而在瘤细胞中则其活性为0。,这一现象提示，脂酶D基因与Rb基因紧密连锁，Rb基因的缺失导致脂酶D活性的相应下降。,同时提示，在体细胞中可能只有一个等位基因缺失，而另一个则是正常的，其基因型可能是 13q-l3RB。体细胞中的正常等位基因如发生突变而失活，则可导致肿瘤发生，其基因型变成13q-l3rb。,脂酶D的研究不仅为阐明肿瘤发生的机理提供了有力的依据，更重要的是，脂酶D基因与Rb基因的紧密

25、连锁，为Rb基因的分离铺平了道路。Lee等于1987年首次成功地分离到了Rb基因的cDNA分子克隆：,以脂酶D的基因组DNA分子克隆为起点，将其两侧远端的 DNA片段作为探针，用染色体步移（Chromosome walking）的方法从人胚视网膜和胎盘的cDNA文库中筛选 Rb的相关基因。,经过反复筛选，获得了一个与脂酶 D相邻的，编码 46kb mRNA基因，定名为视网膜母细胞瘤易感基因，简称Rb基因。,检查了6例视网膜母细胞瘤病人，发现其中2例基因完全不表达，其他4例则表达下降，而且表达的mRNA分子长度减少至4.0kb左右，对进行序列分析的结果表明，它编码一个含816氨基酸残基的蛋白，经

26、计算机检索未发现与该基因同源的序列。,以后各国学者对Rb基因的结构与功能进行了大量的研究：现已明确，Rb基因的基因组DNA总长为200kb，有27个外显子，转录为 4.7kb mRNA，编码含 928氨基酸残基的蛋白质，其分子量为110114kD。,常见的三种蛋白产物的分子量分别为 110kD 未磷酸化形式 112kD 磷酸化形式 114kD,其磷酸化程度在细胞周期中发生周期性变化：G0 期、G1期 蛋白未磷酸化 S期、G2期 大多数蛋白已磷酸化,Rb蛋白磷酸化程度与细胞周期调节因子cde2cde28的活性呈正相关。未磷酸化型Rb蛋白可能是抑制细胞增殖的活性型。,Rb基因可与某些肿瘤病毒的转化

27、蛋白形成稳定的复合物，其中包括SV40抗原，腺病毒EIA蛋白和人乳头瘤病毒E6/E7蛋白，故可能对肿瘤病毒的转化起抑制作用。,Rb蛋白还可以对细胞内转录因子、生长因子起调控作用：,研究资料表明，在正常细胞内可能存在着Rb蛋白的靶蛋白。例如，细胞内谷胱甘肽S转移酶能同Rb基因的LT/EIA结合，这种结合同Rb蛋白的生长抑制功能有关。一旦Rb蛋白同SV40或腺病毒基因组的相应部位结合，或在位点发生了点突变，就可能丧失其生理功能。,转录因子E2F也能与Rb蛋白形成复合物，故Rb蛋白可通过同样的机理来调节E2F因子的转录活性。,另外，Rb基因可抑制细胞内癌基因的表达。例如，用Rb基因转染NIH/3T3

28、细胞可抑制c-fos癌基因在G1晚期的表达。,Rb蛋白还可通过同c-myc，N-myc，erbB-2neu等癌基因产物相结合来调节细 胞的增殖和分化。,2P53基因 在过去十几年里，人们对p53基因的认识经历了一个漫长的历程:最初是通过在鼠类细胞中p53蛋白与DNA肿瘤病毒抗原的结合而发现的。,随后克隆到了p53基因，并证明它能转化鼠类细胞，而且发现在恶性转化的哺乳动物细胞中，p53基因的表达增高。这些资料提示，p53的作用类似于myc或ras，因此可能是一个癌基因。,随着研究的深入，发现了一些矛盾的现象。在对大肠癌、肺癌、乳腺癌等实体瘤进行大量细胞遗传学研究时发现，第17号染色体短臂经常丢失

29、。按照Knudson关于抑癌基因作用模式推测，丢失的染色体片段中可能存在着抑癌基因。,由于己知p53基因定位于17p13.1，所以有 可能成为等位基因丢失的靶基因因此对肿瘤细胞中残留的等位基因进行了序列分析，发现绝大多数残留的p53等位基因己经经历了点突变。这种等位突变的模式表明，p33基因很可能象 Rb基因那样，是一个抑癌基因。,进一步的研究表明，能够使鼠类细胞发恶性转化的基因实质上是突变型p53基因，而野生型p53基因不仅不诱发转化，相反地能抑制转化。,根据现有资料，基因全长1620 kb，由11个外显子组成产生长25kb的mRNA，编码含393个氨基酸残基的蛋白，分子量为53 kD。,蛋

30、白有5个高度保守区，分别位于第1319、117142、171192、236258及270282密码子区域。基因突变大多数发生于外显子，与上述保守区基本相符。,检查等位基因的缺失或突变可采用以下几种方法：限制性 DNA片段长度多态性分析 单链 DNA构型多态性分析 直接 DNA测序,限制性 DNA片段长度多态性（restriction DNA fragment length polymorphism,RFLP）分析：提取 DNA，用适当的限制性内切酶酶解，再用电泳分离。正常细胞的两个等位基因是杂合的，因而显示不同的带型。如果有一个等位基因缺失，就会显示单一的带型，这种现象称为杂合性丢失（loss

31、 of heterozygosity,LOH）；,单链 DNA构型多态性（single Strand conformation polymorphism,SSCP）分析：正常细胞在变性后，经聚丙烯酸胺凝胶电泳，呈现一定的带型。如其中某一个单链发生了突变，就可使单链的构型发生变化，结果使其电泳速度发生变化，导致额外电泳带的出现；,直接 DNA测序：由于突变经常发生于第 58外显子，故可设计这 4个外显子上下游的引物进行聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）扩增，然后分别进行 DNA测序（DNA sequencing）。用这一技术不仅可以测定等位基因缺失或突变的

32、性质，还可对其进行精确的定位。,正常野生型p53（wtp53）基因的转录产物不稳定，半衰期仅20分钟，而突变型p53（mp53）的半衰期则延长至1.47小时，所以如用原位杂交或免疫组化方法来检测，则不能检测到wtp53。而只能检测到mp53的mRNA和蛋白。,只有wtp53蛋白才具有抑癌活性，mp53蛋白则不仅丧失了抑癌活性，而且还能与wtp53蛋白结合使其丧失抑癌功能。所以当一个p53等位基因发生突变时，就足以使细胞呈现恶性表型。,这一点与必须两个等位基因同时失活不同，说明p53基因突变的遗传型是显性的。这一特殊的遗传学现象称之为显性负效应（dominant negative effect）

33、。,wtp53基因的功能是多方面的，主要有以下几面：转录因子活性 wtp53信号区的功能,转录因子活性 p53蛋白是一个转录因子，可通过转录活化区与通用转录因子（multisubunit transcription factor,TF11D）结合并相互作用。,TF11D是TATA结合蛋白（TATA binding protein.TBP）和 TBP相关因子（TBP associated factor,TAF）结合而成的复合物。与TF11D中的TAF结合，TF11D再通过TBP与其下游基因启动子中的TATA box结合而发挥作用。,wtp53的转录活性受腺病毒EIB蛋白及癌基因产物MDM2蛋白的

34、抑制。MDM2通过与wtp53转录活性区相互作用而起到抑制mp53活性的作用。,wtp53信号区的功能 此区34个氨基酸中有12个脯氨酸，含5个脯-X-X-脯重复序列，产生一个SH-3区结合部位。wtp53基因借助于 SH-3区的结合活性，把它同信息传递通道直接联系起来，激活某些靶基因如 p21WAFIcip1的转录活性。,WAF1的蛋白产物p21是细胞周期调节因子，可有效抑制细胞周期蛋白依赖性激酶的活性，从而阻断细胞周期的演进。,总之，wtp53正是通过其转录活性和信号传递功能而发挥其抑癌功能的，主要表现为调节细胞周期和诱导细胞凋亡(将在其他章节中详细加以叙述)。,3.p73基因 p73基因

35、的发现极为偶然。Kaghad等于1997年在利用针对IRS-l结合区的寡核苷酸探针与COS细胞的cDNA文库进行杂交分析中，检出一假阳性克隆它与IRS-l结合区无任何同源性，却与p53基因的大部分保守序列均同源。根据此序列编码的蛋白的分子量，将其命名为p73基因。,利用荧光原位杂交技术将基因定位于lp36区。此区域由于在神经母细胞瘤及其它多种肿瘤细胞中常发生缺失因而被认为可能存在着某种抑癌基因。,p73基因由13个外显子和 12个内含子组成，其表达产物p73蛋白与 p53蛋白有同源性：p73蛋白和 p53蛋白一样具有4个主要的功能区，其氨基端的转录激活结构域与p53 29同源，中部的 DNA结

36、合结构域与 p53 63同源，p53的 6个突变热点p73也完全保守，寡聚结构域有38同源，而羧基端则未检出明显同源。,迄今共发现6种p73基因的转录剪切变异体，它们分别为:p73 p73 p73 p73 p73 p73,p73 由 636个氨基酸残基组成，是全长的 p73蛋白，p73 则由 499个氨基酸残基组成，这是由于 p73基因转录时将外显子 13剪切而缺失了96个氨基酸残基，并导致开放读框的改变。p73 除了最后 5个氨基酸残基为其所特有外，其余均与 p73 的相应序列完全相同。,虽然哺乳动物的 p53蛋白与 p73蛋白的羧基端没有明显的同源性，但是人 p73 蛋白的羧基端与最近在无

37、脊椎动物中发现的p53蛋白同源，说明p53基因可能是从更为原始的“p73样”基因进化而来的。,利用酵母菌杂交系统研究蛋白各种剪切变异体之间相互作用时，发现p73蛋白形成同源二聚体的能力很强，类似于 p53，而 p73 则很弱。P73 和 p73 蛋白与 p53之间有较弱的异型间相互作用。,这些结果表明，p73蛋白各种剪切变异体能形成同型或异型相互作用，而且提示这些作用有可能发生于体内，以便协调整个p53-p73系统的功能。,p73基因在染色体上定位的特殊性以及其蛋白产物与p53蛋白在结构上的相似性，均提示它可能是一个抑癌基因，并且可能与p53蛋白在功能上有相似性：,实验证明，p73过表达时能抑

38、制细胞生长和诱导细胞凋亡，而其突变体则无此功能。p73还能激活部分p53的靶基因，但对绝大多数p53靶基因其作用则明显弱于 p53基因。,例如 p73和 p73对 p21的诱导水平分别比 p53低了6倍和 3倍。但有趣的是，对某些靶基因如 14-3-3 a和 PIG7的诱导水平却远远高于 p53。因此，虽然p53和 p73均能诱导细胞凋亡，但二者导致调亡的信号途径可能有所不同。,另外，不同型 p73蛋白的生物功能强弱不同，其中以p73的功能最强。,随着对p73作用分子机理研究的深入，发现了一些矛盾的现象：在各种肿瘤中均检测不到p73的突变，甚至在一些癌细胞中发现了p73的高表达；,p73-/-

39、小鼠中见不到肿瘤易患现象，但却有严重的发育异常，尤其是脑和免疫系统。反之，p53-/-小鼠易患肿瘤，却无明显的发有异常，这提示有一更原始的基因能够替代p53而完成小鼠某阶段的发育，而这个基因是否就是p73呢？,三种经典的病毒癌蛋白（SV40大 T抗原、腺病毒 EIB55kD和 HPV E6）均能作用于 p53并使之失活，从而使宿主细胞发生恶性转化，却不能与p73蛋白相结合。,以上现象说明，p73抑癌和失活的分子机理尚有待于进一步研究阐明。,4与家族性腺瘤样息肉病(familial adenomatous polyposis,FAP）相关的抑癌基因 FAP过去通常称之为家族性结肠息肉病（fami

40、lial polyposis coli,FPC），是一种常染色体显性遗传病。,近年来对 FAP与抑癌基因之间的关系研究得较多:APC(adenomatous polyposis coli)基因 MCC（mutated colorectal cancer）基因 DCC（deleted in colorectal carcinoma）基因,APC(adenomatous polyposis coli)基因 是 FAP的易感基因，定位于第 5号染色体长臂（5q21），由 15个外显子及 14个内含于组成，其mRNA全长为 8535bp，编码 2842个氨基酸残基的蛋白，分子量为 500kD，与酵母菌

41、中调节 ras族癌基因的基因中一个小片段有同源性。,其基因产物定位于细胞质，APC不仅同FAP有关，而且同散发性结肠癌、肺癌等肿瘤有关。,MCC（mutated colorectal cancer）基因 也是 FAP的易感基因，定位于第5号染色体长臂（5q21），由 17个外显子 16个内含子组成，其 mRNA全长为4181bp，编码 829个氨基酸残基的蛋白，分子量为 93 kD。,在染色体上与APC相邻，同 G蛋白偶联的乙酰胆碱蕈毒碱受体的一小片段有很高的同源性。MCC不仅同FAP及结肠癌有关，还同小细胞肺癌及非小细胞肺癌等有关。,DCC（deleted in colorectal car

42、cinoma）基因 定位于18号染色体长臂（18q21.3），基因全长约 370 kb其 mRNA长 1012 kb，编码含 750个氨基酸残基的蛋白，分子量为 190 kD。其序列同神经细胞粘附分子有同源性。,DCC蛋白与细胞同细胞及细胞同基质之间相互关系有关。在结肠癌中可见到DCC基因的丢失。,5.NF1基因 NF1（neurofibromatosis type l）基因是多发性神经纤维瘤的易感基因，定位于第17号染色体长臂（17q11.2）。,基因全长约6okb，转录成1113kb mRNA，编码2485个氨基酸残基的蛋白。NF1蛋白同ras族癌基因编码的GTP酶活性蛋白有一定的同源性。

43、,NF1蛋白可能为抗增殖蛋白，表现为对 ras p21蛋白的负调节和阻止 ras介导的有丝分 裂信号。NF1失活足以产生良性的神经纤维瘤，但在恶变时可能还有别的基因参与。,6.WT1基因 WT1（Wilms tumors type 1）为Wilms瘤(肾恶性胚胎瘤)的易感基因，定位于第 17号染色作短臂（17p13），基因全长约 59 kb，转录成 3kb mRNA，编码 345个氨基酸残基的蛋白。,该蛋白含 4个锌指纹族，显示与特异性 DNA结合的特性，能同上皮细胞生长因子受体 EGFR-l启动子区域的 CGCCCCCGC序列结合，从而抑制其转录活性。,表达有发育阶段特异性及组织特异性：在胚

44、胎肾上皮、睾丸和卵巢，及一些造血细胞中有表达但在成人细胞中不表达。在纯合性缺失的 Wilms瘤中无 WT1 mRNA表达，但在绝大多数 Wilms瘤中呈高表达。,推测其突变基因可能也象突变型p53那样，表现出显性负效应。突变的基因可过度表达，并对野生型等位基因起抑制作用。,7.ErbA基因 同 P53基因一样，erbA基因以前一直被认为是癌基因。用含 erb A和 erbB基因的禽成红细胞增多症病毒（AEV）感染红细胞系造血细胞，可产生红白血病。,近年来的研究表明，野生型erbA基因是一种抑癌基因编码正常甲状腺素受体可抑制细胞增值，促进终未分化，而突变型 erbA基因也象p53基因那样仅有显性

45、负效应，不但无抑癌作用，反而能抑制野生型 erbA的作用。,8.Krevl基因 日本学者野田亮等用插入到真核细胞表达性质粒的人包皮成纤维细胞cDNA文库提取的总DNA，转染经K-ras癌基因转化的小鼠NIH3T3细胞，从中筛选出扁平型表型逆转的细胞克隆。,最后从这些克隆中分离到一个能特异地抑制上述细胞恶性表型的cDNA片断，命名为Krevl基因。有关这一基因的结构与功能尚少报道，可能与人类肿瘤关系不大。,9.INK4基因 INK4基因的蛋白产物是一种细胞周期抑制蛋白（CKI）。目前已知的 CKI可分为两大类：,INK4（inhibitor of CDK4）特异地抑制CyclinD1 CDK4和

46、cylinD1 CDK6的磷酸化激酶活性；Kip（kinase inhibition protein）抑制现己知的大多数 Cyclin CDK的磷酸化激酶活性。,现已知的INK4包括 pl6 INK4a p15INK4b p18 INK4c p19INK4d 其蛋白质结构与功能具有高度相似性。,为pl6 INK4a、p15INK4b编码的基因位于第9号染色体长臂9q21区。pl6 INK4a基因又称多肿瘤抑制因子（multiple tumor suppressor l,MTSI）、细胞周期蛋白依赖性激酶 4抑制因子（cyclin-dependent kinase 4 inhibitor,CDK

47、4I），是Kamb和Nobori在1994年发现的。,pl6 INK4a基因长约 85 kb，包括 3个外显子和 2个内含子，cDNA全长 444 bp，编码由 148个氨基酸残基组成的。分子量为 16 kD的蛋白质。该类蛋白质的N-末端具有Cyclin box同源框及由 4个回钩状重叠组成的二级结构，该保守结构中氨基酸变异与肿瘤发生之间的相关性高于其他氨基酸部位。,最近发现，小鼠INKK4a基因组能产生、两种转录产物，两者长度基本相同。产物编码pl6 INK4a，产物编码分子量为 19kD的蛋白质称之为 p19ARF（alternative reading frame，ARF）。INK4a基

48、因和 ARF基因分别具有不同的启动子，产生不同的基因产物。,pl6 INK4a基因的转录产物由外显子l，外显子 2和外显子 3组成，而 ARF基因的转录产物则由外显子 1，外显子 2和外显子 3组成。虽然 INK4a基因和 ARF基因共有外显子 2和外显子3，但由于读框互不相同，他们编码的蛋白质序列没有同源性。,两种抑癌机理；pl6 INK4a pRb途径 p19ARF p53途径,pl6 INK4a pRb途径：pl6 INK4a与 CyclinD1竞争性结合 G1期激酶 CDK4CDK6，抑制其对 Rb蛋白（pRb）的磷酸化作用，使游离的转录因子E2F-l与未磷酸化的pRb结合，结果依赖于

49、E2F-1转录的基因不能被转录，从而抑制 DNA合成，抑制细胞由 G1期进入 S期，抑制细胞分裂。,pl6 INK4a还可间接抑制包括DNA合成在内的多种生化反应，从而抑制细胞周期进程。pl6 INK4a失活可导致细胞周期紊乱。,p19ARF p53途径：wtp53基因的表述受mdm2癌基因产物MDM2的负调控。在肉瘤和其他一些肿瘤中，MDM2过度表达，所以尽管wtp53基因本身无突变，却检测不到 wtp53 mRNA的存在。,p19ARF 的N-端结构域可以与 MDM2的 C-端结构域结合，阻止MDM2进入核内并加速其降解，因而可以提高wtp53的稳定性和在细胞核中的水平,抑制肿瘤发生。,p

50、l6 INK4a基因中最常见的失活机理为纯合性缺失，其他两种可能的机理则为突变和甲基化。在多种肿瘤中均可发现pl6 INK4a基因的异常：,在胰腺癌、非小细胞肺癌、神经胶质细胞瘤、急性白血病、恶性黑色素瘤、鼻咽癌等人类肿瘤中的pl6 INK4a纯合性缺失率较高在胰腺癌、食管鳞癌、家族性恶性黑色素瘤及胆管癌等肿瘤中则pl6 INK4a的突变率较高在乳腺癌及胃癌中pl6 INK4a的突变率较低,近年来发现，非小细胞肺癌中 pl6 INK4a 5-CpG岛的甲基化达33，在对大肠癌、前列腺癌、乳腺癌等原发肿瘤和细胞系的检测中也发现了 pl6 INK4a 5-CpG岛的高甲基化。由此可见，pl6 IN