[医学]第15章骨代谢异常的生物化学诊断.ppt

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1、第十五章骨代谢异常的生物化学诊断,教学目标与要求,1.掌握钙、磷、镁代谢异常与代谢性骨病的关系骨矿物质的激素调节与代谢性骨病的关系血清钙、磷和镁的检测方法骨钙素、骨性碱性磷酸酶、型胶原前肽和型胶原交联降解产物在代谢性骨病诊断中的意义,3,2.熟悉骨组织的基本组成、成骨作用与钙化、溶骨作用与脱钙甲状旁腺素、降钙素和1,25-(OH)2D3的主要生理作用 PTH、CT、维生素D的常用测定方法 3.了解PTH、CT及1,25-(OH)2D3的合成与分泌及其调节骨形成和吸收标志物的测定方法,教学目标与要求,4,骨组织组成,5,骨组织与体内钙、磷代谢密切相关。由于多种原因引起骨组织中钙、磷等矿物质、成骨

2、细胞和/或破骨细胞功能异常，造成骨基质、骨细胞代谢紊乱，使骨组织处于异常的疾病状态，总称为骨代谢疾病（异常），包括佝偻病、骨软化病、骨质疏松症等。,骨代谢异常（疾病）,6,目录,返回总目录,7,第一节钙磷镁代谢异常与代谢性骨病,8,1.血钙 钙被称为“生命金属”，占人体体重的1.5%2.0%，其中99%存在于骨骼和牙齿中。血浆中的钙约占机体总钙的0.1%，称为血钙。,一、钙代谢异常,（一）血钙与骨代谢,9,血钙存在形式,10,人体钙分布,11,2.成骨作用（osteogenesis）骨的生长、修复或重建过程 钙化（calcification）成骨过程中，成骨细胞合成和分泌胶原和蛋白多糖等细胞间

3、质成分，形成“类骨质”，继后将钙、磷吸收到纤维的孔隙中进行沉淀结晶的过程,12,影响成骨作用（钙化）的主要因素,血液及骨组织微环境中的CaP浓度乘积正常血中存在的焦磷酸盐等抑制骨钙化 基质中的骨连接素促进羟磷石结晶的形成并规律排列胶原纤维的成熟和类骨质的正常是骨盐沉积的基础骨形态发生蛋白（BMPs）与骨的生成相关,13,3.溶骨作用（osteolysis）骨的溶解和消失，包括基质的水解和骨盐的溶解，主要由破骨细胞引起。又称：骨吸收（bone resorption）脱钙（decalcification）,14,（二）常见钙代谢异常,1高钙血症（hypercalcemia）概 念：血钙浓度超过2.

4、75 mmol/L常见表现：恶心、呕吐、便秘、嗜睡、神志不清等 病程长时可发生组织内钙沉积,15,常见病因：原发性甲状旁腺功能亢进 甲状旁腺素异位分泌 恶性肿瘤骨转移 维生素D中毒 其它疾病,超过90,16,2低钙血症（hypocalcemia）概 念：血钙浓度低于2.25 mmol/L 常见表现：手足抽搐、肌痉挛、喉鸣、惊厥等 骨质钙化障碍包括佝偻病、骨质软化等,17,常见病因：甲状旁腺功能低下 维生素缺D缺乏 慢性肾功能衰竭 新生儿低钙血症 长期低钙饮食或吸收不良等情况,18,二、磷代谢异常,（一）常见磷代谢异常,1高磷血症（hyperphosphatemia）概 念：血磷浓度成人大于1.

5、61 mmol/L 儿童大于1.90 mmol/L 常见表现：低钙血症、骨质钙化障碍,19,高磷血症常见病因：甲状旁腺功能减退 维生素D增多症 慢性肾功能不全或衰竭 多发性骨髓瘤及某些骨病 新生儿生理状况下血钙较成人低，而血磷明显高于成人,20,2低磷血症（hypophosphatemia）概 念：血磷浓度小于0.8 mmol/L常见表现：鸭态步、骨痛、佝偻病、病理性骨折、精神错乱、抽搐和昏迷等,21,低磷血症常见病因：甲状旁腺功能亢进 佝偻病或骨软化症 糖利用增加 乳糜泻 肝硬化和肾脏疾病 使用雌激素、避孕药和苯巴比妥等药物,22,（二）低磷血症与代谢性骨病,1.低磷性佝偻病和骨软化症血磷显

6、著降低，并有明显的肌无力病人下肢无力，步态蹒跚或呈鸭态步,2.X连锁家族性低磷血症又称遗传性低血磷性维生素D抵抗性佝偻病病因：肾小管对磷的重吸收障碍；肠道对磷的吸收减少后果：血磷降低而引起佝偻病的骨改变,23,三、镁代谢异常,（一）常见镁代谢异常,1低镁血症（hypomagnesemia）概 念：血清镁低于0.75 mmol/L常见表现：神经-肌肉障碍和精神与行动的异常,24,消化道吸收障碍 尿路丢失增多 内分泌疾病 其它疾病,低镁血症常见病因,25,2高镁血症（hypermagnesemia）概 念：血清镁高于1.25 mmol/L常见病因：肾脏疾病 内分泌疾病 其它疾病,26,（二）镁代谢

7、异常与代谢性骨病,大鼠实验表明，低镁幼鼠的钙化骨减少、发生多种骨骼畸形,高镁可影响成骨作用，发生骨营养不良,返回章目录,27,第二节激素调节与代谢性骨病,28,一、甲状旁腺素（parathormone，PTH）,（一）甲状旁腺素合成及分泌,甲状旁腺主细胞,前甲状旁腺素原 115aa,甲状旁腺素原 90aa,PTH 84aa,29,（二）PTH的生理作用：升高血钙、降低血磷,1.对骨的作用 动员骨钙入血，使血钙升高 增加骨吸收和骨生成，骨吸收大于骨生成 2.对肾的作用,钙重吸收,磷重吸收,保钙排磷,30,3.对小肠的作用,PTH,激活肾脏1-羟化酶,活性D3增加,肠道吸收钙增加,31,（三）甲状

8、旁腺功能异常与代谢性骨病,轻型的原发性甲状旁腺功能亢进患者中重型原发性甲状旁腺功能亢进患者典型骨病变：纤维性囊性骨炎（棕色瘤）,32,二、降钙素（calcitonin，CT）,（一）降钙素的合成与分泌,甲状腺滤泡旁细胞合成和分泌单链多肽，由32个氨基酸残基组成血钙是影响CT分泌的主要因素,33,抑制破骨、促进成骨抑制肾小管对钙、磷的重吸收抑制肾维生素D-1-羟化酶活性因雌激素减少而减少,（二）降钙素的生理作用降低血钙、降低血磷其主要作用机制为：,34,三、活性维生素D,（一）活性维生素D的生成,35,（二）活性维生素D的生理作用：升高血钙、升高血磷,基本途径,活性维生素D,靶细胞上维生素D受体

9、,激素受体复合物,二聚体,维生素D反应元件,相关基因的转录和翻译,钙磷代谢调控,视黄醛X受体,36,1.对小肠的作用：促进小肠对钙磷的吸收和转运,小肠粘膜上皮细胞维生素D受体,活性维生素D,相关基因的转录和翻译,钙结合蛋白表达上调,Ca2+-Mg2+ATP酶增加,小肠钙转运增加,37,2.对骨的作用：溶骨和成骨的双重作用,活性维生素D,增加破骨细胞数量和活性,协同PTH增加破骨细胞数量,增加血钙,增加胶原,促进溶骨（低血钙时）,促进成骨（高血钙时）,3.对肾脏的作用：促进肾小管对钙、磷的重吸收,38,（三）维生素D缺乏与代谢性骨病,1佝偻病和骨软化症,活性维生素D缺乏,儿童,成人,骨质软化症,

10、佝偻病,39,2肝性佝偻病,肝功能障碍,25-羟化酶下降,25-羟化酶,活性维生素D缺乏,胆道阻塞钙皂形成,维生素D吸收障碍,维生素D缺乏,佝偻病症状,40,3肾性佝偻病、肾性骨营养不良（renalosteodystrophy）,41,4.维生素D依赖性佝偻病（vitamin D depedent rickets，VDDR）又称假性维生素D缺乏症。其特点为：,肾小管上皮细胞1-羟化酶先天性缺陷常染色体隐形遗传维生素D缺乏症状典型，发病早大剂量活性维生素D治疗可使疾病缓解,42,5.维生素D抵抗（vitamin D resistance）,机体对正常剂量甚至大剂量的维生素D或1,25-(OH)2

11、D3的低反应或无反应现象,其特点为：维生素D受体基因突变：常染色体隐性遗传 常见的有三个主要位点：Q259E、G319V和R73X临床上具有典型的佝偻病症状和体征约50%的患者对任何形式的维生素D治疗无效,43,钙磷代谢的激素调节,44,包括雌激素和雄激素，对处于生长阶段的个体骨骼发育和成熟十分重要。雌激素对1,25-(OH)2D3的合成、降钙素和PTH分泌均有重要的调节作用。雄性激素能促进蛋白质和骨基质的合成，促进肌肉和骨骼生长。国内外报道中老年人骨矿物质丢失速度与血清性激素含量呈负相关。,四、性激素,45,定义：骨质疏松症是一种全身性的骨量减少，以骨组织显微结构退化为特征，并引起骨脆性增加

12、、骨强度降低的疾病。此时骨矿物质和骨基质等比例减少，基本特点在于单位体积内骨组织量减少。分类：原发性 继发性（其中退行性骨质疏松症发病率最高）,骨质疏松症,46,退行性骨质疏松症的分型,型骨质疏松症（绝经后骨质疏松症）,型骨质疏松症（老年性骨质疏松症）,47,（一）型骨质疏松症,基本原因是雌激素分泌不足破骨细胞过于活跃，骨转换增加 骨矿含量减少，导致骨质疏松 表现为单位体积内的骨量减少 血液生化指标基本正常 但骨形成和骨吸收的指标有增高,48,（二）型骨质疏松症,中老年人骨的吸收大于骨形成，导致骨质疏松 细胞学基础：破骨细胞的吸收增加 成骨细胞功能衰减主要由于老年人身体各机能退化而致骨形成与骨

13、吸收的生化指标均有降低倾向,返回章目录,49,第三节血清钙磷镁的测定,50,一、血清钙的测定,（一）血清钙测定方法概述总钙测定,标 本：血清或低浓度肝素抗凝血浆测定方法：滴定法、比色法、火焰光度法、原子吸收分光光度法、同位素稀释质谱法等 决定性方法：同位素稀释-质谱法（IFCC）参考方法：原子吸收分光光度法（IFCC）常规方法：邻甲酚酞络合酮（O-CPC）法（卫生部）,51,（二）血清钙测定方法概述离子钙测定,标 本：血清、低浓度肝素抗凝血浆或全血测定方法：生物学法、透析法、超滤法、金属指示剂法、ISE法等参考方法：ISE法,52,（三）血清钙测定总钙测定O-CPC 法,1.测定原理,2.方法

14、评价,操作简便、快速、稳定，同时适于手工和自动化分析反应体系的pH值对结果影响较大,53,（四）血清钙测定离子钙测定ISE 法,1.测定原理,Nernst方程式：在一定条件下，ISE的电位与溶液中的被测离子浓度的对数成正比,2.方法评价,操作简便、快速、重复性好准确度和敏感性高，影响因素少,54,二、血清磷的测定,（一）血清磷测定方法概述,标 本：血清、肝素化血浆常用方法：磷钼酸还原法、磷钼酸紫外分光光度法、酶法、原子吸收分光光度法、同位素稀释质谱法等决定性方法：同位素稀释质谱法常规方法：磷钼酸紫外分光光度法、磷钼酸还原法,55,（二）血清磷测定磷钼酸还原法,1.测定原理,2.方法评价,方法简

15、便、快速，稳定体系中加入Triton X-100等表面活性剂，则不需要除蛋白即可直接测定,56,（三）血清磷测定酶法,1.测定原理,2.方法评价,血清磷测定的发展方向显色稳定，线性范围宽，干扰因素小，可用于自动化分析所用的酶试剂比较贵,57,三、血清镁的测定,（一）血清镁测定方法概述,标 本：血清（非钙离子络合抗凝剂）测定方法：比色法、原子吸收分光光度法、酶法、同位素稀释质谱法等决定性方法：同位素稀释质谱法参考方法：原子吸收分光光度法常规方法：甲基麝香草酚蓝（MTB）比色法 Calmagite染料结合法,58,（二）血清镁测定比色法,1.测定原理,2.方法评价,方法简单、实用，可用于自动化分析

16、采血后应尽快分离血清，而且避免溶血,EGTA(乙二醇二乙醚二胺四乙酸,EGTA：乙二醇二乙醚二胺四乙酸,59,（三）血清镁测定酶法,1.测定原理,异柠檬酸,-酮戊二酸,NADP+,NADPH（340nm处吸光度下降）,镁离子，ICD,2.方法评价,成本低廉、影响因素小，线性范围宽试剂稳定性欠佳，4下只能保存2周左右,返回章目录,60,第四节 骨代谢异常的生物化学测定,61,一、骨代谢调节激素的测定,（一）甲状旁腺素的测定,1.测定方法概述 存在形式：PTH-N、PTH-C和PTH-M测定形式：PTH-C、PTH-M和完整PTH主要方法：RIA、IRMA、ELISA、ICMA等 国外采用IRMA

17、法和ICMA法测定完整的PTH分子 国内应用最普遍的是RIA法,62,IRMA：免疫放射法ICMA：免疫化学发光法 2.RIA法测定PTH测定对象：PTH-M和PTH-C方法类型：竞争性RIA法 125I 标记PTH-M和PTH-C 125I标记的PTH-M和PTH-C与病人样本中的PTH-M和PTH-C竞争抗体结合位点。,63,（二）维生素D的测定,1.测定方法概述 25-(OH)D3是反映机体维生素D营养状态的理想指标 1,25-(OH)2D3更适合用受体结合法进行分析 25-(OH)D3的测定方法：RIA-CPB和HPLC等 1,25-(OH)2D3的测定方法：RIA、RRA、生物学方法

18、等 以RRA和RIA最为普遍,RIA-CPB：放免竞争性蛋白结合法RRA：放射受体法,64,2.25-(OH)D3的测定 目前主要采用RIA法佝偻病大鼠血清中维生素D结合蛋白为特异性的结合物基本流程：有机溶剂提取血清 与放射性标记物竞争与维生素D结合蛋白结合 反应平衡后分离游离型和结合型标记物 液闪计数、计算浓度评价：方法简便，结合蛋白较稳定 测定前都需要对25-(OH)D3提取纯化,65,3.1,25-(OH)2D3的测定（1）RRA采用维生素D缺乏或正常的鸡肠道维生素D受体采用Sep-Pak色谱柱代替高效液相色谱的纯化步骤（2）RIA采用佝偻病大鼠血清中维生素D结合蛋白作为特异性的结合物，

19、比受体更稳定，更方便,66,（三）降钙素的测定,1.生物分析法：降血钙效应分析2.放射免疫分析法：样品CT、放射性标记CT竞争性地与CT特异性抗体结合 3.夹心放射免疫分析：快速、灵敏、特异,67,二、骨形成标志物的测定,（一）骨钙素（osteocalcin,OC）的测定,又称骨-羧基谷氨酸蛋白（BGP）由成骨细胞合成和分泌的一种活性多肽主要生理功能是维持骨的正常矿化速率血骨钙素是反映骨代谢状态的一个特异和灵敏的生化指标测定BGP的方法应用最多的是放射免疫法和酶联免疫法,68,（二）骨性碱性磷酸酶（B-ALP）测定,ALP是在碱性条件下催化磷酸酯水解的酶类 B-ALP来自成骨细胞，是骨形成的特

20、异性标志物 血清B-ALP测定方法：总体分为电泳法和非电泳法 应用较多的方法是放射免疫法 HPLC是目前B-ALP测定分辨率最高的方法,69,B-ALP增高常见于：甲状腺、甲状旁腺功能亢进 恶性肿瘤骨转移 佝偻病、骨软化病 骨折和绝经后骨质疏松症等B-ALP测定意义：骨病早期诊断骨病 疗效的评价和预后的判断 骨转移癌的病程和治疗效果的监测,70,型胶原前肽是胶原的延伸段 多检测型前胶原羧基前肽(PICP)来评价骨形成 PICP的检测大多采用RIA和电化学发光免疫分析（ECL）血清中型胶原前肽水平在一定范围内是反映成骨细胞活动和骨形成以及反映型胶原合成速率的特异指标,（三）型胶原前肽测定,71,

21、三、骨吸收标志物的测定,HOP是体内胶原代谢的终产物之一 尿HOP排出量可以反映骨吸收和骨转换程度 尿HOP增高见于：儿童生长期、甲状旁腺功能亢进 骨转移癌、慢性肾功能不全 畸形性骨炎、佝偻病和软骨病 高转换的骨质疏松患者 尿HOP指标特异性较差，也缺乏灵敏性 尿HOP测定方法：分光光度法 离子交换色谱法和反相HPLC法,（一）尿羟脯氨酸（hydroxyproline,HOP）,72,吡啶酚，脱氧吡啶酚型胶原降解产物 型胶原交联N末端肽 型胶原交联C末端肽型胶原降解产物是反映骨吸收和骨转换的良好指标,（二）型胶原交联降解产物测定,73,脱氧吡啶酚（D-Pyr）和吡啶酚（Pyr）是型胶原分子之间

22、构成胶原纤维的交联物 尿中Pyr和D-Pyr浓度是反映骨胶原降解和骨吸收的最灵敏和特异的生化指标之一 尿中D-Pyr的含量通常用尿肌酐来校正 常用方法：HPLC-荧光检测法、竞争性酶免疫法,74,型胶原交联C末端肽（CTX）和型胶原交联N末端肽（NTX）均是型胶原分解的产物。血清CTX水平是破骨细胞胶原降解的灵敏指标：与骨形态计量学骨吸收参数呈显著正相关 与其它骨吸收生化指标如Pyr和D-Pyr呈正相关常用ELISA法测定,75,TRAP主要存在于破骨细胞血TRAP水平主要反映破骨细胞活性和骨吸收状态血浆TRAP增高见于：原发性甲状旁腺机能亢进、慢性肾功能不全、畸形性骨炎 骨转移癌、卵巢切除术

23、后、高转换率的骨质疏松等血浆TRAP降低见于：骨吸收降低的疾病，如甲状旁腺功能降低TRAP活性测定方法：免疫法（缺少特异性识别骨TRAP的检测方法）,（三）抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）,返回章目录,76,1.骨组织包括细胞和细胞间质两部分，前者主要有骨细胞、成骨细胞和破骨细胞三类，后者包括钙、磷、镁、钾、钠和锰等无机成分和胶原、非胶原蛋白、蛋白多糖和脂质组成的有机成分。,2.钙、磷、镁以及骨组织的正常代谢受多种激素的严密调控，包括PTH、CT、活性维生素D3和性激素等。PTH由甲状旁腺合成和分泌，升高血钙、降低血磷；降钙素降低血钙、降低血磷；活性维生素D3升高血钙、升高血磷。,【小结】,77,3.测定血清矿物质以及相关激素的水平对于代谢性骨病的诊断、鉴别诊断等有重要的意义，包括血钙测定、血磷测定、血镁测定以及血清中PTH、CT、维生素D及其代谢产物、骨钙素和骨性碱性磷酸酶等物质的测定。,【小结】,78,骨代谢异常生化诊断方面目前的进展主要在于：开发灵敏度、特异性更高、操作更简便的测定方法用于更方便、更准确地测定这些物质成分。探索骨代谢疾病新的生化标志物并确定其参考范围、临床意义。,【展望】,