最新：人类白细胞抗原基因分型技术平台规范化建设及临床应用专家共识.docx

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1、最新：人类白细胞抗原基因分型技术平台规范化建设及临床应用专家共识摘要人类白细胞抗原(HLA)基因位于人染色体6p2L31区域，占人基因组的1/3000。HLA基因结构复杂，具有多基因性、高度多态性、单体型遗传、连锁不平衡、种族差异性、区域分布性等特征。近年随着HLA基因分型技术的不断创新，对技术平台的规范化建设、临床检测项目性能验证和性能确认方案的实施、检测全流程的质量控制、结果的分析和解读、供者选择的咨询和临床应用等方面都带来新的问题和挑战。本共识结合我国HLA基因分型技术在临床开展的实际情况，系统梳理了HLA基因分型技术平台规范化建设及临床应用中的关键内容。第一部分从人员、仪器设备、试剂和

2、耗材、实验方法学、环境等方面，提出规范化建设HLA分型技术平台的基本要求，介绍了NGS技术检测HLA基因分型性能确认方法及性能指标的选择。第二部分重点阐述HLA基因分型检测前、中、后全流程质量控制的关键点，HLA基因分型结果报告和发布的质量控制，结果解读和信息系统的管理。第三部分重点叙述HLA基因分型的临床咨询和推广应用。在广泛征求国内HLA和移植领域专家的修改意见和反复讨论后定稿，旨在推动HLA基因在医学领域的发展及临床应用。人类主要组织相容性复合体(majorhistocompatibilitycomplex,MHC)位于人类6号染色体短臂的21.31区域，DNA片段长度3600Kb,由一

3、组紧密连锁的基因群组成，其编码的抗原分子在人类称为人类白细胞抗原(humanleukocyteantigens,HLA),HLA具有结构复杂、多基因性、高度多态性、单体型遗传、连锁不平衡等特征7。HLA-A、B、C属于经典HLA-I类基因座位，HLA-DR、DQ.DP属于经典HLATl类基因座位，HLA-E、F、G、H属于非经典HLA-I类基因座位。最新国际免疫遗传学/人类白细胞抗原(IPDTMGT/HLA)数据库(2023-043.52版本)公布HLA-I类位点共有25509个等位基因，HLA-II类位点共有10754个等位基因。基因测序分型(sequencingbasedtyping,SB

4、T)技术是HLA基因分型的金标准，具有特异性强及准确性高的特点；但其针对HLA-I类基因座位的第2、3、4外显子以及HLATI类基因座位第2、3外显子的关键区域进行扩增和测序，存在测序区域覆盖不全、难以判断不能确定等位基因型分型结果等局限性。近年来，国内外已使用下一代测序(nextgenerationsequencing,NGS)技术进行HLA基因分型，NGS技术是对HLA基因组全长序列进行测序，其测序的深度和广度都高于SBT法，具有通量大、速度快、可同时检测经典HL-I类和HLA-H类基因、非经典HLA-I类基因等优势，并且98%以上样本可直接获得唯一、最高等位基因分辨率的分型结果，不仅为患

5、者赢得了最佳的临床治疗及移植时间，而且为HLA基因在异基因造血干细胞移植(allogenichematopoieticstemcelltransplantation,alIo-HSCT)、疾病相关性、药物和输血不良反应等临床研究中的应用提供科学依据。因此，HLA基因分型从最早血清学技术到NGS技术的革命性突破，对HLA配型实验室技术平台的规范化建设、质量管理控制、结果报告和解释、临床应用等方面，均带来新的问题及挑战。由于HLA具有复杂的等位基因多态性、种族差异性，因此，其存在分型技术的选择、结果分析和判读、结果解释和临床咨询等相关问题，都可能会影响HLA基因分型检测结果的准确性及临床决策。为解

6、决HLA基因分型技术中关键问题，在参考国内外相关指南、行业标准、规范和文献的基础上，中国输血协会人类组织抗原专业委员会、中华医学会血液学分会组织HLA、移植等相关领域的专家共同起草了本共识，系统梳理了HLA基因分型技术平台规范化建设及临床应用中的关键内容，对于WS/T785-2021人类白细胞抗原基因分型检测体系技术标准中的内容不重复阐述2，第一部分HLA基因分型技术平台规范化建设一、建设HLA基因分型技术平台的基本要求（一）申请开展临床检测的资质推荐意见L对于开展HLA基因分型等临床检测服务的实验室（简称：实验室），应依据并符合卫办医政2010194号文件医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办

7、法的要求申请备案，各省市可根据卫生行政部门对技术审核和登记备案的管理要求实施后开展临床检测工作。实验室可根据自身发展需求申请中国合格评定国家认可委员会(ChinaNationalAccreditationServiceforConformityAssessment,CNAS)组织的IS015189医学实验室认可3,及美国组织相容性和免疫遗传学协会(AmericanSocietyforHistocompatibilityandImmunogenetics,ASHD实验室国际认证等4o实验室开展HLA基因分型等临床检测项目，应将接收的样本视为具有潜在感染性样本进行处理。为了防止检测前，如接收和处理

8、样本过程中产生的气溶胶；检测过程中如扩增子污染；检测后医疗废弃物处理等造成生物安全隐患，特别是实验室如接收外部样本，尤其是境外样本，考虑可能存在潜在感染风险更大，建议进行生物安全实验室(bio-safetylaboratory,BSD2级备案。如果HLA基因分型由检验科、病理科等科室开展，可与所在科室一同备案。(一)场地和设施的要求推荐意见2：实验室根据开展的临床检测项目、检测物、覆盖专业及生物安全要求设计实验场地，必须按功能设计生活区和工作区，工作区可分为普通和核心区域。单向设计人流、物流(试剂或耗材)、样本流、污物流（废弃物、废水）、气流（清风、送风、排风）。合理布局逃生通道、喷淋和洗眼装

9、置、防火设备、卫生设置等，以及配备温湿度设备、监控设备（冷链、摄像）、服务器和数据储存设备、生物安全柜等。1 .设施设备：实验室可设置独立的样本接收室，配备电脑、通讯设备和紫外消毒设施，以满足样本接收时各类送检信息核对、登记和录入、与临床沟通完善送检信息、患者及供者样本整理、接收与拒收以及暂存样本的需求。2 .生物安全防护：实验人员在样本接收和处理时，应按照BSL-2要求做好个人防护，对样本外包装进行消毒及统一处理。标本开盖易产生气溶胶、溢洒等，该类操作均在生物安全柜内按标准操作规程（standardoperationprocedure,SOP）进行。实验结束后，应按照医疗废弃物处理原则对实验

10、废弃物、废液进行处理，并对生物安全柜等设备进行清理、消毒和维护。3 .防污染措施：实验室应按照WS/T785-2021行业标准的规定，建立防污染检测体系和擦拭检测措施。（三）人员资质的要求推荐意见3：实验室应根据从事技术平台不同，配备有相应学历、专业和资质证书的专业技术人员。对于关键岗位技术人员，如实验室质量和技术负责人、授权签字人、给出临床建议、咨询意见和解释的人员等，在申请相关实验室认证时，均有一定的要求。1 .结果审核人员：大学本科以上，在实验室工作经历至少5年以上,熟练掌握各项技术，具有分析和解决常见问题的能力。2 .结果报告发布人员：实验室应对报告发布人员的资质予以规定，如CNAS认

11、可实验室对于授权签字人的资质要求：本科、5年以上专业经历、中级以上职称；ASHI认证实验室要求报告发布岗位人员应经过相关认证机构授权，通常由实验室负责人、主管担任。3 .结果解读、临床咨询、临床建议人员：经实验室主任授权，由具有专业背景、技术能力、工作经历、研究能力和沟通能力等综合能力体现的专业人员从事该工作。CNAS.ASHI建议临床咨询岗位人员应具有医学检验、生物学等相关专业博士学历学位，或临床医学本科及以上学历学位，通常由实验室主任、负责人或其他由实验室主任授权人员担任。（四）培训与考核推荐意见4：实验室应针对不同岗位、年资、职称等，制定分阶段的岗位培训计划及相应的考核内容和方法。培训内

12、容应包括但不限于实验室相关制度、生物安全、专业技术、质量管理、仪器设备使用和维护等。培训方式可为实验室集中面授、专业组内培训、独立实验操作等。员工经培训并通过考核后授权上岗，从事与培训内容对应的岗位工作。实验室对人员的培训、考核及周期应按照WS/T785-2021行业标准、CNAS.ASHI有关规定执行。可对新员工、老员工、轮岗员工设置不同的培训内容和考核时间，低年资人员应侧重考核实验操作能力，高年资人员应侧重考核解决问题能力。建议新入职人员应首先接受实验室相关制度和生物安全培训，再接受专业技术和质量管理相关培训，培训时长一般要求3个月以上。(五)仪器、试剂的选择推荐意见5：实验室必须根据临床

13、需求选择经确认符合临床预期用途的检验程序，应选择国家药品监督管理局(NationalMedicalProductsAdnIiniStratiOn,NMPA)批准注册的试剂和仪器开展临床检测项目I5L并进行性能验证。性能验证应满足但不限于试剂生产商说明书中声明的内容，结果应符合试剂说明书中性能指标的参数。实验室除按照试剂、仪器说明书的要求外，还应参照医学检验相关国标、行标等要求,建立仪器、试剂和耗材的采购、评估和储存，仪器使用、维护、维修和校准等必须的SOP文件。1 .基于Luminex技术平台应用序列特异性寡核昔酸探针(SeqUenCespecificoligonucleotideprobe,

14、SSOP)方法进行基因分型：应配备流式荧光检测仪及配套分析软件，试剂包括扩增、杂交试剂，仪器数据采集所需的鞘液、校准微珠等。2 .基于SBT技术进行基因分型：应配备基因测序仪，试剂主要包括扩增及测序试剂，基因扩增产物纯化试剂、产物测序前溶解核酸的试剂，如高度去离子甲酰胺及基因分析仪所用的分离胶，如POP-7聚合物等。还需要配备与试剂配套的HLA基因分型分析软件。3 .基于NGS技术进行基因分型：应配备高通量测序仪及配套分析软件,可依据测序读长、测序通量，综合考虑测序准确率、运行时间、测序成本、测序质量，结合生物信息支持的可用性、平台的灵活性、可扩展性等，选择边合成边测序、半导体测序、联合探针锚

15、定聚合测序等测序平台。文库构建试剂建议选择扩增子文库构建法或探针杂交捕获法的配套试剂；选择无核酸去离子水、分子生物级无水乙醇；实验的各种量程枪尖、PCR反应管等耗材推荐选用低吸附度耗材。4 .NGS技术上机测序试剂：根据测序仪型号和检测通量选择高通量测序平台的上机测序试剂。不同型号测序仪配套上机测序试剂不同，同型号测序仪也配备有不同通量的上机测序试剂。5 .生物信息平台设备基本要求：NGS平台数据量较大，需配备服务器或工作站电脑满足分析软件要求。电脑配置应满足生物信息分析的要求，数据储存建议配备服务器或其他存储设备，并进行异地备份。6 .其他仪器设备：配备包括核酸抽提仪、浓度测定仪、基因扩增仪

16、、电泳系统及成像系统、磁力架（可放置96孔板、2ml离心管）、恒温孵育仪、核酸片段分析仪、QUbit荧光定量仪、超净台、生物安全柜、纯水仪、离心机、移液器、冰箱及混匀震荡仪等设备。（六）服务协议的评估和签署推荐意见6：实验室接受委托检验服务，应与委托检验的机构签订服务协议。服务协议中的内容应包括但不限于协议双方的责任和权限，实验室资质，HLA基因分型技术平台和分辨水平，质量控制管理能力，项目价格，报告发放时间，样本采集、运送、保存的要求，临床咨询及解答临床疑难病例的服务，报告发放对象保密性规定，合作时间等内容。经双方协商后签署服务协议，并应定期评审服务协议。1 .检测要求：实验室依据协议中送检

17、样本检测目的不同，如移植前患者和供者HLA基因分型、二次移植供者选择、HLA杂合性缺失（IOSSofheterozygosity,LOH）检测、HLA与疾病相关性等，实验室应与委托方协商后明确采用的方法学，以满足检测目的和对送检样本的要求，并建议在服务协议中予以体现。2 .保密性规定：实验室如与中国造血干细胞捐献者资料库管理中心(简称中华骨髓库)有签约协议，必须遵守中华骨髓库所有管理要求，如信息保密性规定、网络安全等。中华骨髓库供者及患者的分型报告，实验室必须在中华骨髓库指定信息系统内上传，不可向第三方泄露供受者信息及实验室数据。实验室必须严格保密患者和供者、临床医生、其他服务对象的信息以及实

18、验室数据。移植医院患者及亲缘供者的分型报告仅可授权发送至申请医生、患者本人，或者服务协议明确的委托机构授权代表人。报告授权发放对象建议在服务协议中予以体现。二、开展HLA临床检测项目的性能验证实施方案推荐意见7：实验室在选择NMPA批准注册商品化体外诊断(in-vitrodiagnostic,IVD)试剂和仪器开展HLA基因分型临床检测项目时，应验证检测系统性能参数的结果是否符合临床预期用途，建立检测前、中、后全流程的关键环节质量控制指标、SOP文件和记录表单等，证实该临床检测项目的测量系统、实验方法、试剂和耗材、仪器设备等均达到性能指标要求，满足预期用途后才能在临床开展。而对于选择合成引物、

19、探针，购买扩增缓冲液、酶等试剂自建实验方法；或使用NMPA商品化试剂但改变了其预期用途、试剂组分或实验操作流程，均需按照实验室自建检测方法（IabOratOrydevelopedtest,LDT）或仅供科研使用的试剂（researchuseonly,RUO）进行项目性能确认管理。（一）基本要求实施项目性能验证和性能确认方法的基本要求见表1。表1实睡HLA基因分型临床检测项目性能舲证和性傩确认方法的基本要求项目件能验证博能认目的满足厂商宣称性使和假期用途清足检测偿期用途的特定要求近用慈HI商晶化八|）.配隹检澧系统加1定出合的检测系统的标准方法LDT等作标津方法.实验空谀计或制定的方法、超出位期

20、用途使川的标布方法.修改后的实验方法样本类啜检测采用厂商宣称的样本类笈使用各种样本类型检濡均需认样本数献不低于20例,可根据倒期用途地加至少50例,根据停期用途一般不低于100例样本来源临床样本（已知结果为由）.肥彳方所控.室何丽怦样木脸床已知结果样本（至少“3家不同机构提供）.室间质评或比对样本性僮指标符合率、我复性.检测限符合率、收复性.检测限、特异性、灵敏度判断标净试剂或检潸系统说明的提供的性能参数实脸条根据值IW用途C行建立（可拿导相关标净或文献）故行者开展唯床检溜实验空开展帙床检源实骐室.方法研发机构注:HLA为人类在/胞执蜿:1VD为体外诊断产M:IJ）T为实验室自建检测方法（二）

21、性能验证推荐意见8：HLA基因分型检测项目的性能验证应包括但不限于以下内容：样本类型、核酸提取及质量评估、符合率（金标准方法学、基因型）、检出限、重复性。必要时对基因扩增效率、杂交或纯化得率、测序峰、分析软件等内容进行验证。性能验证方案、检测过程、原始结果、评估报告、记录表单等均应在实验室长期保存。根据IILA等位基因复杂性，建议性能验证样本数量不低于100例，样本数量可根据预期用途增加。推荐意见9：实验室应选择与试剂配套的软件进行数据分析，用于软件安装的设备参数及运行环境应符合说明书的要求。应对所安装的软件及涉及的IPDTMGT/HLA数据库、HLA常见及有记录（ComnIonandwell

22、-documented,CWD）的等位基因数据库等进行性能验证，用于验证的样本应涵盖CM）和Rare基因、纯合子和杂合子、存在碱基改变等不同等位基因类型。验证内容应包括但不限于分型结果的正确性、软件的功能、分析参数及软件初步分析结果与人工判断结果的一致性和差异性。根据性能验证结果制定实验室分析软件系统的SOP文件。1 .样本选择：实验室应选择已知结果的临床样本、国家标准品和参考品、室间质评样本等。样本类型如外周血、口腔黏膜细胞（拭子或唾液）、脐带血、组织及细胞等，需要针对不同样本类型进行性能验证。此外，样本类型的选择应包括基因分型结果为纯合子或杂合子的样本，各位点应尽量涵盖中华骨髓库发布的中国

23、常见及确认的HLA等位基因表（CWD）（目前为2.4版本）中80%以上常见等位基因，并建议涵盖10%有记录的等位基因和1婷2%罕见等位基因。2 .核酸提取及质量评估：实验室应针对不同样本类型制定不同技术平台的核酸提取方法及质量评估标准。按照试剂说明书、WS/T785-2021行业标准、CNAS-GL039等规定对DNA的完整性、浓度、纯度进行评估。NGS技术在定量核酸浓度时推荐使用荧光染料法，不推荐使用定量总核酸的分光光度计（NanodrOP法）或其他紫外吸收法。核酸提取方式可采用磁珠吸附法或离心柱提取法，对于外周血细胞数偏高或偏低的患者样本推荐选择离心柱提取法，提高核酸纯度和回收率。唾液样本

24、需选用专用抽提试剂进行核酸抽提，保证唾液样本内DNA完整性。抽提后的DNA样本重悬于PH8.09.O的缓冲溶液（如Tris-HCl）中以便长期保存。采用NGS方法提取核酸要求DNA结构完整，无抑制酶活性的有机溶剂或过高浓度的金属离子，无生物大分子如蛋白质、多糖和脂质分子，并排除其他核酸分子（如RNA）污染。建议使用高通量测序试剂推荐并己验证的方法和提取设备，或实验室已验证的其他商品化试剂。3 .符合率：用已知HLA等位基因分型的DNA样本进行与金标准方法学的基因型符合性检测，结果判定标准应为与原基因型100%符合。采用去离子水进行核酸抽提的产物作为阴性样本，阴性样本应无分型结果或无探针捕获信号

25、、测序信号。4 .检出限：根据试剂说明书声明的检出限验证DNA的有效浓度。如SBT方法提示DNA浓度介于I（TlOong1,SSOP方法提示DNA浓度介于20250ng/ulo建议选择该浓度范围内低值、中间值、高值梯度各35个DNA样本进行重复检测3次，结果判断标准为处于检出限浓度内的样本100%检测到基因型，且与已知基因型100%符合。5 .重复性：重复性包括批内、批间、人员间重复性结果的符合率，应根据说明书的声明方式去进行验证。如选择35个DNA标准品或已知结果的样本，在不同批次由同一技术人员重复检测35次，并在同一批次实验内进行复孔检测35次，从而验证批间、批内的重复性，要求与已知基因型

26、100%符合。6 .分析灵敏度：分析灵敏度是指用该分子检测技术能够检测到生物样本中待测靶核酸分子的最低含量，定性实验中分析灵敏性常用最低检测限来表达。7 .分析特异性：分析特异性在HLA基因分型技术中特指标本中的干扰物对检测正确性的影响。内源性干扰物主要为药物等，外源性干扰物常见于采集和处理标本的过程，如抗凝剂等。实验室可根据临床需求、厂家声明和样本特点进行干扰物验证。8 .分析软件系统：（1）数据分析软件的功能：包括软件对仪器产出原始数据的导入和识别、对NGS方法碱基序列的识别和拼接、对SBT方法碱基序列的识别、对SSOP方法探针荧光信号的识别、与参考数据库的比对及判断等位基因的碱基差异和初

27、步分型结果等功能。（2）SBT方法关键参数的分析：包括对测序峰碱基信号强度、碱基识别质量、序列开头引物结合部位碱基剪切位置的合理性、与参考序列的吻合性及正反向序列的一致性、双峰判断比值及背景值等的分析。（3）SSOP方法关键参数的分析：包括对微珠最低读数、阴性质控微珠最高值、阳性质控微珠最低值、探针阴/阳性反应判断正确性等的分析。（4）NGS关键参数的分析：包括对测序深度、均一性、覆盖度、等位基因平衡等的分析，详见下文。三、应用NGS技术开展HLA基因分型性能确认方法实验室应用NGS技术开展IILA基因分型，应选择有NMPA批准注册证的高通量测序仪及测序试剂。根据文库构建方法不同，可选择扩增子

28、法或杂交捕获法的文库构建试剂及与试剂配套的分析软件。故在临床开展HLA基因分型检测前需对整个项目进行性能确认，包括湿实验和干实验两个部分17,8。（一）湿实验的性能确认推荐意见10：湿实验性能确认应包括但不限于以下内容：仪器设备、试剂和耗材、样本处理、核酸提取和质量评估、文库制备、上机测序步骤等。1 .测序仪的性能确认：由仪器工程师在安装后按照说明书所要求的仪器性能指标，对光学系统、液路系统、进样系统等逐项验证，并进行标准品运行测试。仪器性能指标应达到仪器生产商声称的指标且满足临床预期用途，方视为仪器性能合格。2 .文库制备：文库制备是将基因组DNA片段化，并在片段末端连接寡核甘酸接头的过程。

29、目前应用NGS技术进行HLA基因分型文库构建方法常为扩增子法9、杂交探针捕获法IH）。不同建库方法其文库制备原理不同，但文库制备过程中片段选择、文库质量测定、上机测序文库浓度调整均为关键实验步骤。（1）扩增子法：采用多重PCR扩增富集目标区域，扩增子经DNA片段化、末端修复、接头连接、磁珠纯化、富集扩增等步骤完成文库构建。扩增子法文库构建可检测单核甘酸多态性（SingIenucleotidepolymorphisms,SNP）、小片段的插入或缺失，但覆盖范围受引物限制、PCR多重扩增均一性等制约。（2）杂交探针捕获法：采用磁珠的液相捕获技术，利用生物素标记探针在杂交过程中捕获目标区域。片段化反

30、应采用连接在磁珠上的转座酶，同步实现基因组DNA片段化和接头（包括标签序列和测序引物序列）连接，通过片段选择、探针杂交捕获、富集等步骤完成文库构建。杂交探针捕获法因无PCR扩增步骤，避免了PCR反应引入的偏向性，重复基因组区域覆盖度较均匀。杂交探针捕获法文库构建可检测SNP、大片段的插入或缺失等，但受探针捕获效率、序列中GC分布的制约。（3）文库制备流程：核酸浓度：不同文库制备方法要求核酸浓度不同，一般不低于10ngl,或根据文库制备试剂说明书要求调整初始核酸浓度。基因组片段化：常用片段化方式有内切酶法和转座酶切法。扩增子法采用核酸内切酶法片段化，经末端修复，通过一步或两步磁珠纯化法实现目的基

31、因与标签序列及测序引物的连接。杂交探针捕获采用转座酶方法可同步实现片段化和连接过程。标签序列：称为barcode或index,一般612bp,均属人工合成的已知序列。两种建库方法均使用双标签标记，将多份样本混合后加入一张芯片，测序后需通过识别序列上的标签区分不同样本。片段选择：两种建库方法均通过调整磁珠的比例，分选连接标签和测序引物目的基因片段，并去除标签二聚体及大小不符合建库要求的片段。磁珠的体积是影响文库片段长度大小的关键。文库质量：采用QUbit荧光染料法检测文库浓度，或采用实时荧光定量PCR仪(qPCR)检测文库中有效连接接头的文库浓度；必要时通过核酸片段分析仪(如AglientTap

32、eStation系统)验证文库片段大小，即插入片段和接头序列的总长度，应主峰明显、无杂峰、无接头、无引物二聚体，合格文库插入片段长度可根据文库制备试剂说明书确定。3 .上机测序：定量后文库需调整摩尔浓度，以提高测序质量。实验室根据测序仪及型号，对上机测序文库终摩尔浓度进行验证。按文库制备试剂说明书编写上机样本信息，确定样本唯一标签序列。边合成边测序法推荐在检测体系中加入序列已知的平衡文库(PhiXControlv3),比例1%5%,用于判断测序反应中单碱基连接反应是否提前或滞后、监测测序平台整体性能、测序实验运行质量，起到均衡四种碱基荧光信号的作用。上机测序试剂中的试剂卡盒应避免反复冻融，使用

33、前上下反复混匀后确认底部无气泡，并确保流动槽或芯片位置放置正确。控制仪器室湿度在30%75乐避免流动槽玻璃表面凝结水汽，影响成像清晰度。(二)干实验的性能确认推荐意见IL干实验的性能确认应包括但不限于以下内容：测序仪产生数据的质量指标：如簇密度、簇通过率、碱基识别质量百分比（qualityscores,Q值）、数据产出量；分析软件的参数：如碱基识别、标签识别、序列拆分、参考序列比对、碱基插入、缺失、错配的识别；HLA分型数据分析的参数：如测序深度、测序均一性、测序覆盖率、等位基因平衡等。1 .测序仪产生数据的质量指标：边合成边测序法、联合探针锚定聚合测序法平台产生的测序数据主要包含序列信息和相

34、应的碱基质量值，包括簇密度、簇通过率、Q值、数据产出量等。半导体测序法平台产生数据的质量指标，包括测序碱基信号值，如Ion球形颗粒（ionsphereparticles,ISP）密度、平均测序短序列（reads）长度、ISP连接DNA链的比例等。Q值是测序过程中碱基识别的错误概率，每个测序平台都会给出Q值，以Q30表述，每批实验均需监测Q值。数据产出量用单次测序可获得序列信息的基因片段数量或可测定的碱基数量表示。2 .分析软件的参数：高通量测序仪常用仪器本地数据格式转换工具（如：bcl2fastq）进行碱基识别，对下机原始数据，依据序列上的不同标签进行序列拆分，获得不同样本的fastq、bam

35、.等格式测序数据，完成初级分析。导入与试剂配套数据分析软件后，通过去除质量低于Q30的碱基、引物二聚体序列、重复序列，去除接头序列（标签序列、引物序列、测序引物结合序列）、与现用版本IPD-IMGT/HLA数据库的参比序列，实现测序序列与参比数据库的比对，进行比对后数据处理，获得HLA等位基因型的分析结果，完成数据二级分析。使用与试剂配套数据分析软件进行数据二级分析，设置参数可包括但不限于以下内容：生成分型数据最低有效的reads数目、最大reads数目、可分析reads最短长度、可允许插入最大碱基数、缺失最大碱基数、错配最大碱基数、判断等位基因分型结果时任意碱基位置的最低有效reads数目、

36、碱基可识别的最低比例、杂合子最低等位基因平衡度等。在上述测序仪产生数据的质量指标达标、分析软件参数均合格的情况下，才能进行HLA分型的数据分析。3 .HUk分型数据分析的参数：（1）测序深度：指特定区域碱基识别的有效核酸测序片段，用reads数目来表示，reads数目越多，深度越高，检出碱基的可信度越高。（2）测序均一性：在基因组某一特定区域内测序的一致性。测序深度和均一性是测序数据质量的主要因素，评估均一性可以计算测序深度的最低比例。（3）测序覆盖率：是达到给定深度的测序碱基占整个基因组或目标区域的百分比，与文库构建试剂相关。高通量测序可覆盖HLA基因的外显子，或包含内含子及非翻译区（Unt

37、ranSlatedregions,UTRs）。（4）等位基因平衡：等位基因多态性位置两个碱基的比例，区分纯合位点或杂合位点。两个碱基比例相近时判为等位基因平衡，当低于可接受的阈值时判为等位基因不平衡。（三）应用NGS技术开展HLA基因分型检测项目性能确认的判断指标推荐意见12：HLA基因分型检测项目性能确认的判断指标，可参照厂商或研发者在试剂盒或检测系统说明书中的声明，应包括但不限于以下内容：基因型符合率、精密度、最低检测浓度、数据量、Q3080%的百分率、测序深度、均一性、测序覆盖率、序列拼接长度或平均reads长度、高背景碱基识别和判断、等位基因序列拼接、等位基因不平衡等。1 .基因型符合

38、率：采用已知分型结果的DNA（如临床、室间质评或能力验证项目）样本和去离子水的阴性样本，与金标准方法学检测结果比较，分型结果与已知结果100%符合。2 .精密度：包括重复性和重现性，结果100%一致。当使用多台基因测序仪或扩增仪器时，须评估仪器间重复性。3 .最低检测浓度（limitofdetection,LoD）：指至少95%的样本能够准确检出基因分型结果的最低检测浓度。杂交捕获法文库构建一般要求样本的初始核酸浓度LOD为10ng/u1,样本体积10u1；建库产物总浓度不低于3ngl,片段不小于675bp；以采用边合成边测序法MiSeqDX仪器为例，推荐上机文库摩尔浓度首先调整至4nmolL

39、,再稀释到合适的上机模板浓度。建议实验室基于自身的检测系统，评估并设定LoD值。4 .数据量：测序产出数据量通常在26GB,以常用边合成边测序法的双端150bp、V2芯片为例，HLA产生数据量一般要求应达到45GBo5 .Q3080%的百分率：采用Q30判断碱基质量，杂交捕获方法要求95%的样本Q30值88%。6 .测序深度：杂交捕获方法要求95%的样本测序深度不低于100X150,最低测序深度30X；扩增子方法建议最低测序深度不低于200Xo7 .均一性：要求reads片段在检测区域均匀分布。8 .测序覆盖率：要求各基因位点测序序列100%覆盖目标区域，尤其关键外显子区域必须完全覆盖并达到所

40、要求的测序深度。杂交捕获和扩增子方法均可对HLA-I类A、B、C位点，HLATl类DRB1、DQB1、DPBl、DRB345.DQAKDPAl位点进行全基因组或全外显子测序。对于关键外显子，两种方法均需查看HLA-I类基因EXOn2、3、4区域，HLA-II类基因EXOn2、3区域。9 .序列拼接长度或平均reads长度：杂交捕获方法要求reads序列拼接长度为700bp左右；扩增子方法要求平均reads长度100bp。10 .高背景碱基的识别和判断：测序错误、序列拼接错误导致测序序列中某个位置碱基的数目或比例不符合软件分析阈值，出现的位置和碱基类型固定，常与等位基因相关，造成结果分析错误。需

41、记录影响结果分析的高背景碱基位置、类型及比例，建立碱基有效识别及无效识别的判断标准，在后续结果分析中加以分析。特别应注意对于实施移植后送检样本，在分析中需要区别移植后患者样本中因错配移植产生的等位基因嵌合，不可判为高背景。11 .等位基因序列拼接：等位基因序列包括完全拼接和无法完全拼接，无法完全拼接是高通量测序结果存在不能确定等位基因型的主要原因。如等位基因为杂合子，参考区分序列的两个保守多态性碱基间距离，超过试剂最长序列拼接长度，如DPB1*O5：01+13:O1DPB1*135:01+519:01；或数据库中等位基因序列不完整时，如DPB1*O2：01+05:O1DPB1*414:01+7

42、44:01,均提示不能确定的等位基因型结果。12 .等位基因不平衡：杂交捕获方法中当两个等位基因碱基序列的reads比例38%、扩增子方法1：3或更低时，提示等位基因不平衡，低比例等位基因易造成漏检。存在高GC碱基的核甘酸区域，等位基因序列扩增或捕获效率较低，是造成序列中reads比例不平衡的主要因素，实验室应建立可接受的等位基因不平衡最低比例。四、性能验证或性能确认报告推荐意见13：HLA基因分型性能验证或性能确认报告至少应包括但不限于以下内容：目的；原理和方法学简介；试剂和耗材；仪器设备维护及校准；实验场地和生物安全；样本来源及性质；性能验证或确认指标（符合率、检出限、重复性、特异性、生信

43、分析、软件分析、数据库等）；SOP文件和简易操作卡；结果分析和原始记录；验证结论；结果报告、报告单发放方式；结果解释或解读（特殊类型、基因变异、家系分析等）；技术的局限性、不足及需要说明的问题；参考文献；附录（原始结果、试剂和仪器重要说明书）等。五、SOP的建立推荐意见14：实验室各技术平台通过实验方法的建立和优化，建立及完善检测系统，明确常规检测过程中每个环节的质控指标及判断标准，形成项目的SOP文件体系及其实验流程记录表，并在规定时间内完成评估及更新。SOP文件可包括但不限于以下内容：目的，原理和方法，仪器和试剂，样品类型、样本采集、运送处理和保存，标准实验操作步骤及关键实验步骤，数据分析

44、软件的使用，质量控制规则，结果分析、结果报告和解释、进一步检测的建议，常见问题及解决办法，分析软件的升级及IPD-IMGT/HLA数据库更新，试剂的接收、出入库及质量控制，仪器的维护校准及维修，参考文献、附表及附录等。对于特殊样本类型及让步检验时，需要在结果分析和报告时进行相应的解释和备注。第二部分HLA基因分型检测全过程的质量控制一、HLA基因分型检测前的质量控制推荐意见15：实验室应建立标本采集、暂存、运输、接收、验收的质量管理程序文件，提供标本采集和项目手册，对关键环节设立质量目标、质量指标；建立不同样本接收和拒收标准及标本前处理的SOP文件。样本的识别性、唯一性、溯源性、安全性等内容的

45、风险评估是检验前质量管理的重点，及应监控纠正措施和持续改进的效果。检测申请单的设置可由临床或协议单位共同参与评估。1 .申请单：拟进行allo-HSCT或器官移植而寻求HLA基因分型的患者,申请检测除需提供基本信息外，还需明确患者与供者关系，至少两种标识（姓名、出生年月或身份证号），申请的分型位点和分辨率水平，以及与样本质量或结果判断相关信息，如首次/二次移植、白细胞计数、化疗及用药情况、患者的致敏史、接受的抗体清除治疗方案及治疗时间等，因此需要由临床或协议单位共同参与申请单内容制定及评估。2 .样本接收和拒收：WS/T785-2021行业标准已规定实验室对样本信息不足、样本处理及运输不当、样

46、本量不能满足检测、抗凝方式不当作为拒收样本处理。对于恶性血液病患者，因疾病、药物治疗等原因,可存在外周血白细胞数量异常、口腔黏膜细胞(拭子或唾液)样本采集过程是否正确等情况，都将影响样本质量并对检测结果造成影响。实验室需针对接受样本的来源、类型等，建立不同样本接收、拒收程序文件，及前处理的SoP文件。对于血液病患者需明确样本送检时间为alIo-HSCT移植前或移植后，以及具体的送样时间；初诊时高白细胞计数的患者需达到缓解或部分缓解后再送样检测；化疗患者需待化疗结束后、下一化疗周期开始前、且外周血白细胞计数正常时再行采样；特殊药物如羟基胭、靶向药物治疗期不可送检外周血样本。髓系或淋系白血病移植后

47、复发、需二次移植的患者，建议同时送检外周血、口腔拭子或唾液。患者化疗或因病情原因，白细胞计数无法达到采样要求，临床加急情况下可送检口腔黏膜细胞样本。3 .质量指标：实验室应设置相应的质量指标，如样本丢失率、周转时间(turn-aroundtime,TAT)等，并定期对质量指标和目标值进行评估，评价纠正措施的有效性，以达到持续改进的目的。4 .风险评估：样本丢失、相互混淆是样本接收和处理过程的风险重点。实验室为防止样本混淆，样本唯一性标识应具有可溯源性，检验前的唯一标识可为检验申请单编号、中华骨髓库无关供者骨髓编号或患者编号、供/患者姓名等；检验中及检验后的唯一标识可为实验室检测编号。为防止样本

48、丢失，实验室应可监控样本接收和登记过程，全流程应有核对和交接记录。二、HLA基因分型检测过程中的质量控制（一）试剂和关键耗材的质量控制推荐意见16：实验室应建立试剂、关键耗材的质量管理程序文件，包括试剂订购、接收、保存、质控、使用期（包括分装后使用期）、有效期等过程。通过质控可确保检测结果的正确性，对于不同批号试剂宜选择5个以DNA质控品或已知结果的样本进行质量验证；相同批号不同批次试剂宜选取3个DNA质控品或已知结果的样本进行质量验证；与试剂盒同批次的配套试剂，宜与试剂盒同时进行质量验证，不同批次的配套试剂、其他通用试剂及自配试剂应单独进行质量验证。应建立试剂分装、储存时间等有效性验证，确保试剂在有效期内使用，并保存质控记录。试剂和关键耗材的质量验证结果应与已知基因型100%符合，所有质控记录和原始数据均应存档保留。1 .配套试剂：SSOP方法配套试剂主要为热稳定DNA聚合酶（TaqDNApolymerase）,SBT方法配套试剂主要为基因扩增产物的消化试剂、纯化试剂、高度去离子甲酰胺、POP-7聚合物等，NGS方法配套试剂主要为建库、纯化、标签、测序试剂等。2 .通用试剂：实验过程中使用的DNA浓度、片段检测试剂，无核酸去离子水，无水乙醇，电泳缓冲液、琼脂糖、染料、DNA标